Name: Imaging iniziale di microdomini Ca2+ in cellule T primarie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 56 s
Description: Scopri come rilevare i microdomini di Ca²⁺ nelle cellule T primarie murine e umane mediante microscopia a fluorescenza. Questo metodo consente di studiare le vie di segnalazione del calcio nelle cellule immunitarie.

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<meta charset="utf8"></head><body>Tecnica di imaging ad alta risoluzione per la rilevazione di microdomini Ca2+ nelle cellule T

<ol><li>Wolf, I. M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frontrunners+of+T+cell+activation%3A+Initial%2C+localized+Ca2%2B+signals+mediated+by+NAADP+and+the+type+1+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Frontrunners of T cell activation: Initial, localized Ca2+ signals mediated by NAADP and the type 1 ryanodine receptor.</a> Sci Signal. 8 (398), 102(2015).</li>
<li>Taguchi, T., Mukai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity+signalling+and+membrane+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Innate immunity signalling and membrane trafficking.</a> Curr Opin Cell Biol. 59, 1-7 (2019).</li>
<li>Trebak, M., Kinet, J. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling in T cells.</a> Nat Rev Immunol. 19 (3), 154-169 (2019).</li>
<li>Diercks, B. -P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ORAI1%2C+STIM1%2F2%2C+and+RYR1+shape+subsecond+Ca2%2B+microdomains+upon+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">ORAI1, STIM1/2, and RYR1 shape subsecond Ca2+ microdomains upon T cell activation.</a> Sci Signal. 11, 0358(2018).</li>
<li>Cheng, H., Lederer, W. J., Cannell, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+sparks%3A+Elementary+events+underlying+excitation-contraction+coupling+in+heart+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Calcium sparks: Elementary events underlying excitation-contraction coupling in heart muscle.</a> Science. 262 (5134), 740-744 (1993).</li>
<li>Feske, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling+in+lymphocyte+activation+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling in lymphocyte activation and disease.</a> Nat Rev Immunol. 7 (9), 690-702 (2007).</li>
<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).</li>
<li>Kummerow, C., Junker, C., Kruse, K., Rieger, H., Quintana, A., Hoth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+synapse+controls+local+and+global+calcium+signals+in+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">The immunological synapse controls local and global calcium signals in T lymphocytes.</a> Immunol Rev. 231 (1), 132-147 (2009).</li>
<li>Brock, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P2X4+and+P2X7+are+essential+players+in+basal+T+cell+activity+and+Ca2%2B+signaling+milliseconds+after+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">P2X4 and P2X7 are essential players in basal T cell activity and Ca2+ signaling milliseconds after T cell activation.</a> Sci Adv. 8 (5), 9770(2022).</li>
<li>Weiß, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+to+laminin-1+and+collagen+IV+induces+the+formation+of+Ca2%2B+microdomains+that+sensitize+mouse+T+cells+for+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Adhesion to laminin-1 and collagen IV induces the formation of Ca2+ microdomains that sensitize mouse T cells for activation.</a> Sci Signal. 16 (790), 9405(2023).</li>
<li>Diercks, B. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+Ca2%2B+microdomains+for+the+adaptive+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The importance of Ca2+ microdomains for the adaptive immune response.</a> Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1871 (5), 119710(2024).</li>
<li>Woelk, L. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DARTS%3A+an+open-source+Python+pipeline+for+Ca2%2B+microdomain+analysis+in+live+cell+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">DARTS: an open-source Python pipeline for Ca2+ microdomain analysis in live cell imaging data.</a> Front Immunol. 14, 1299435(2024).</li>
<li>Diercks, B. -P., Werner, R., Schetelig, D., Wolf, I. M. A., Guse, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+calcium+imaging+method+for+local+calcium+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">High-resolution calcium imaging method for local calcium signaling.</a> Methods Mol Biol. 1929, 27-39 (2019).</li>
<li>Python. Python. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.python.org/downloads/">https://www.python.org/downloads/</a> (2024).</li>
<li>Anaconda. Anaconda. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://docs.anaconda.com/free/anaconda/install/index.html">https://docs.anaconda.com/free/anaconda/install/index.html</a> (2024).</li>
<li>git. git. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://git-scm.com/book/en/v2/Getting-Started-Installing-Git">https://git-scm.com/book/en/v2/Getting-Started-Installing-Git</a> (2024).</li>
<li>DARTS. DARTS. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://github.com/IPMI-ICNS-UKE/DARTS">https://github.com/IPMI-ICNS-UKE/DARTS</a> (2024).</li>
<li>DARTS. DARTS GitHub Repository. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://ipmi-icns-uke.github.io/DARTS/">https://ipmi-icns-uke.github.io/DARTS/</a> (2024).</li>
<li>Oracle. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.oracle.com/de/java/technologies/downloads/">https://www.oracle.com/de/java/technologies/downloads/</a> (2024).</li>
<li>Time-Dependent Entropy Deconvolution. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://ipmi-icns-uke.github.io/TDEntropyDeconvolution/General/2-usage.html#input-parameters">https://ipmi-icns-uke.github.io/TDEntropyDeconvolution/General/2-usage.html#input-parameters</a> (2024).</li>
<li>Gu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+NADPH+oxidases+DUOX1+and+DUOX2+synthesize+NAADP+and+are+necessary+for+Ca2%2B+signaling+during+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Dual NADPH oxidases DUOX1 and DUOX2 synthesize NAADP and are necessary for Ca2+ signaling during T cell activation.</a> Sci Signal. 14 (709), 3800(2021).</li>
<li>Roggenkamp, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HN1L%2FJPT2%3A+A+signaling+protein+that+connects+NAADP+generation+to+Ca2%2B+microdomain+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">HN1L/JPT2: A signaling protein that connects NAADP generation to Ca2+ microdomain formation.</a> Sci Signal. 14 (675), 5647(2021).</li>
<li>Heßling, L. D., Troost-Kind, B., Weiß, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NAADP-binding+proteins+-+Linking+NAADP+signaling+to+cancer+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophy.+Acta+Mol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">NAADP-binding proteins - Linking NAADP signaling to cancer and immunity.</a> Biochim Biophy. Acta Mol Cell Res. 1870 (7), 119531(2023).</li>
<li>Dynes, J. L., Amcheslavsky, A., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+targeted+single-channel+optical+recording+reveals+multiple+Orai1+gating+states+and+oscillations+in+calcium+influx%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetically targeted single-channel optical recording reveals multiple Orai1 gating states and oscillations in calcium influx.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (2), 440-445 (2016).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>&alfa;-CD3</td><td>BD Pharmingen</td><td>553058</td><td></td></tr><tr><td>&alfa;-CD28</td><td>BD Pharmingen</td><td>553295</td><td></td></tr><tr><td>Anaconda Anaconda</td><td></td><td>https://docs.anaconda.com/free/anaconda/install/index.html&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>Filtro cellulare</td><td>Biofil</td><td>CSS-013-070</td><td>70 &micro; m diametro</td></tr><tr><td>Countess Contatore di celle automatizzato</td><td>Invitrogen</td><td>A49865</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini di copertura</td><td>Paul Marienfeld GmbH</td><td>101202</td><td></td></tr><tr><td>DARTS</td><td>GitHub</td><td>https://github.com/IPMI-ICNS-UKE/DARTS&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Gibco, Thermo Fisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>EasySep CD4+ Kit di isolamento delle cellule T</td><td>Stemcell</td><td>19852</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Magnetic Multistand</td><td>Stemcell</td><td>18010</td><td></td></tr><tr><td>Fluo 4-AM</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>Fura Red-AM</td><td>Invitrogen</td><td>F3020</td><td></td></tr><tr><td>Gibco RPMI 1640 medio</td><td>Gibco, Thermo Fisher</td><td></td><td></td>11875093</tr><tr><td>Git</td><td>GitHub</td><td>https://git-scm.com/book/en/v2/Getting-Started-Installing-Git</td><td></td></tr><tr><td>olio da immersione</td><td>Leica</td><td>11513859</td><td></td></tr><tr><td>Siero per polpacci neonato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4637</td><td></td></tr><tr><td>Oracle</td><td>Oracle</td><td>https://www.oracle.com/de/java/technologies/downloads/&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptamicina</td><td>Gibco, Thermo Fisher</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Proteina G perline magnetiche</td><td>Merck</td><td>LSKMAGG02</td><td>10 &; Pitone diametro M</td></tr><tr><td></td><td>Pitone</td><td>https://www.python.org/downloads/&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Grasso al silicio (basilone)</td><td>Bayer</td><td>291-1220</td><td></td></tr><tr><td>Deconvoluzione dell'entropia dipendente dal tempo</td><td>GitHub</td><td>https://ipmi-icns-uke.github.io/TDEntropyDeconvolution/General/2-usage.html#input-parameters</td><td></td></tr><tr><td>Tween</td><td>q-biogene</td><td>TWEEN201</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging iniziale di microdomini ca2+ in cellule t primarie

Imaging Initial Ca2+ Microdomains in Primary T Cells

In questo protocollo, abbiamo delineato un metodo aggiornato per visualizzare e analizzare i microdomini iniziali di Ca2+ nelle cellule T primarie di topo sulla base di precedenti lavori del nostro gruppo 1,13. Questo approccio è stato determinante per svelare il coinvolgimento dei canali CRAC come ORAI1, STIM1 e STIM2, così come dei canali di rilascio intracellulare di Ca2+ come RyR1 nei primi eventi di segnalazione del Ca2+ 4.
Per fare ciò, abbiamo studiato la formazione spontanea di microdomini Ca2+ mediante imaging di topi primari non stimolati Orai1-/-, Stim1-/-, Stim2-/- e Ryr1-/- e li abbiamo confrontati con le cellule T primarie di topo WT. L'analisi della formazione di microdomini Ca2+ comprendeva la velocità di insorgenza del segnale, l'ampiezza del Ca2+ e il numero di segnali per piano confocale. In particolare, ad eccezione delle cellule T Stim2-/-, tutte le cellule T KO hanno mostrato una significativa diminuzione dei segnali locali di Ca2+ e una ridotta concentrazione di Ca2+ citosolico libero basale rispetto alle cellule WT. Questo ci ha portato a concludere che la formazione di microdomini di Ca2+ è strettamente legata all'interazione di ORAI1, STIM1 e RyR14. Inoltre, abbiamo identificato e caratterizzato con successo microdomini spontanei di Ca2+ sulla membrana plasmatica. Questi microdomini di Ca2+ erano caratterizzati da un'ampiezza di Ca2+ di 290 nm ± 12 nm. L'utilizzo di un approccio codificato a colori per i segnali di Ca2+ ha permesso la visualizzazione di microdomini di Ca2+ in tutta la cellula. I risultati hanno ulteriormente evidenziato la rapida insorgenza di microdomini Ca2+, visibili entro millisecondi, e la capacità di questo metodo di rilevare segnali Ca2+ con una longevità di pochi millisecondi4. Questi microdomini spontanei del Ca2+ sono stati successivamente identificati come microdomini del Ca2+ dipendenti dall'adesione (ADCM), dipendenti non solo da SOCE, ma anche agenti attraverso la cascata di segnalazione FAK/PLC-γ/IP3 10 e il coinvolgimento di P2X49. Inoltre, questa tecnica è stata fondamentale per confermare le doppie ossidasi 1 e 2 (DUOX1/2) come enzimi21 produttori di NAADP e HN1L/JPT222 come una delle proteine leganti NAADP23 recentemente scoperte.
La Figura 2 mostra esempi rappresentativi di microdomini Ca2+ nelle cellule T CD4+ primarie dopo il contatto con le perline da WT e nei topi P2x4-/- e P2x7-/-. Le cellule sono state caricate con i coloranti Ca2+ Fluo-4 AM e Fura Red AM e sono state sottoposte a imaging a una velocità di acquisizione di 25 ms (40 fotogrammi/s). Per imitare la formazione delle sinapsi delle cellule T, le cellule sono state stimolate con perle rivestite anti-CD3/anti-CD28. La formazione iniziale del microdominio Ca2+ è stata analizzata 1 s prima e fino a 15 s dopo il contatto con il cordone utilizzando la pipeline DARTS. Al contatto con la perlina, la cellula WT ha mostrato una rapida formazione di microdomini Ca2+ nel primo secondo dopo la stimolazione nel sito di contatto della perlina (Figura 2A). Questi microdomini di Ca2+ si sono ulteriormente espansi in tutta la cellula nei successivi 15 s dopo il contatto con la perlina. A differenza delle cellule WT, le cellule P2x4-/- e P2x7-/- (Figura 2B) hanno mostrato una ridotta formazione di microdomini Ca2+ dopo la stimolazione della perlina, così come per il livello basale P2x4-/-a inferiore prima del contatto con la perlina. Questi risultati rappresentativi sono in linea con i risultati precedentemente pubblicati da Brock et al.9, che indicano la formazione di microdomini Ca2+ nelle cellule T WT direttamente dopo il contatto con le perline oltre 15 s e segnali inferiori per frame nelle cellule P2x4-/- e P2x7-/- . Inoltre, l'ampiezza nelle cellule P2x4-/-è risultata significativamente ridotta, stabilendo ulteriormente il ruolo della segnalazione purinergica nei microdomini Ca2+ dipendenti dall'adesione.
Inoltre, questo metodo può essere utilizzato anche per visualizzare i microdomini iniziali di Ca2+ in cellule T CD4+ umane primarie (Figura 3). In linea con le cellule T murine primarie, i microdomini iniziali di Ca2+ sono evocati nel sito di contatto della sfera. Tuttavia, la risposta complessiva al Ca2+ sembra verificarsi su una scala temporale diversa rispetto alle cellule T CD4+ murine.
L'analisi dei segnali locali di Ca2+ in modo manuale non è fattibile in quanto piuttosto laboriosa e soggettiva per il singolo investigatore. Pertanto, abbiamo precedentemente sviluppato un algoritmo in MATLAB Simulink utilizzando i suoi toolbox di elaborazione e ottimizzazione delle immagini per la post-elaborazione13 per l'analisi di microdomini Ca2+ locali.
Recentemente, abbiamo sviluppato una nuova pipeline di post-elaborazione open source chiamata DARTS per l'analisi di microdomini Ca2+ nell'imaging di cellule vive ad alta risoluzione utilizzando la piattaforma software Python12. Qui, è possibile selezionare diversi algoritmi di deconvoluzione, a seconda delle preferenze dell'utente, eseguire una normalizzazione della forma della cella per compensare i cambiamenti morfologici della forma della cellula e definire parametri specifici del microscopio e della misurazione (ad esempio, scala, frequenza dei fotogrammi, tempo misurato) (Figura 4).
Dopo aver selezionato i parametri per l'analisi del microdominio Ca2+ , viene aperta una seconda finestra pop-up per ogni singola misurazione per definire il contatto del cordone (Figura 5). Per definire il contatto del cordone, l'utente può scorrere manualmente il file tiff utilizzando il cursore e selezionare il telaio del contatto del cordone individualmente. Il contatto del cordone viene selezionato facendo clic sul sito di contatto del cordone (Figura 5, perlina e contatto del cordone indicati da anello e freccia gialli) e selezionando la cella. Questo passaggio deve essere ripetuto per ogni cella di interesse. Infine, viene applicata la post-elaborazione automatizzata delle immagini e i dati dei risultati vengono riassunti e salvati in un foglio di calcolo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67075/67075fig01.jpg"> Figura 1: Flusso di lavoro della preparazione dei vetrini per l'imaging. (A) Aggiungere e stendere sia BSA che PLL sul vetrino utilizzando un secondo vetrino coprioggetti. (B,C) Per costruire una camera, incollare gli o-ring in gomma usando grasso siliconico sul vetrino. Assicurarsi che l'intero anello sia coperto da un sottile strato di grasso per avere un adeguato isolamento della camera. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67075/67075fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67075/67075fig02.jpg"> Figura 2: Cellule rappresentative di microdomini Ca2+ dipendenti dal recettore delle cellule T in una cellula T CD4+ murina primaria di tipo selvatico (WT) (A), P2x4-/- o P2x7-/-(B). Le cellule T CD4+ sono state isolate negativamente e caricate con Fluo-4 AM e Fura Red, come descritto sopra. Le cellule T sono state analizzate utilizzando la pipeline DARTS, ottenendo immagini cellulari comparabili con i risultati precedentemente pubblicati9. (A) Cellula T primaria WT 1 s prima della stimolazione con perle rivestite anti-CD3/anti-CD28 e fino a 15 s dopo la stimolazione (barra della scala 5 μm), nonché grafico della superficie 3D di uno zoom da 0 s a 0,65 s nella regione di contatto della perlina (barra della scala 1 μm). (B) Corsia superiore: cellula T primaria P2x4-/- rappresentativa 1 s prima e fino a 15 s dopo la stimolazione con microsfere. Corsia inferiore: cellula T primaria P2x7-/- rappresentativa 1 s prima e fino a 15 s dopo la stimolazione con perline. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67075/67075fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67075/67075fig03.jpg"> Figura 3: Microdomini Ca2+ in una cellula T umana primaria rappresentativa dopo stimolazione con TCR. Le cellule T CD4+ umane primarie sono state isolate da cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) mediante smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) da buffy coat e caricate con Fluo-4 AM e Fura Red, come descritto sopra. La figura mostra una cellula T umana primaria 1 s prima della stimolazione con perle rivestite anti-CD3 e fino a 15 s dopo la stimolazione (barra della scala 5 μm), nonché un grafico della superficie 3D di uno zoom da 6,25 s a 7,5 s nella regione di contatto della perlina (barra della scala 1 μm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67075/67075fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67075/67075fig04.jpg"> Figura 4: L'interfaccia utente grafica (GUI) DARTS. La GUI è suddivisa in quattro aree. Nell'area Input/Output, è necessario fornire informazioni sui dati grezzi, inclusa la directory di origine e la configurazione dell'immagine (due canali per file o canali separati), nonché la directory dei risultati. Nell'area Proprietà di misurazione, l'esperimento deve essere descritto con tutte le informazioni pertinenti, come la scala (micron per pixel), la frequenza dei fotogrammi e l'intervallo di misurazione relativo al punto di partenza determinato in seguito. Successivamente, è possibile assemblare una pipeline di elaborazione composta da fasi di post-elaborazione, normalizzazione della forma e analisi effettiva (rilevamento del microdominio e accumulo di dati del bersaglio). Infine, le impostazioni possono essere salvate o caricate dal computer. Una volta impostata l'analisi, fare clic su Avvia per procedere. Per saperne di più sulla configurazione, visita https://ipmi-icns-uke.github.io/DARTS/General/Usage.html. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67075/67075fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67075/67075fig05.jpg"> Figura 5: Definizione manuale dei contatti a cordona. Se le perle vengono aggiunte alle celle durante l'esperimento, il tempo iniziale di contatto della perlina con una cella di interesse e la posizione del contatto devono essere definiti manualmente. Questo viene fatto scorrendo i fotogrammi con il cursore e trovando una posizione (x,y) in un punto temporale t. Per compilare automaticamente il campo delle informazioni di contatto del cordone, l'utente fa clic sulla metà sinistra dell'immagine del microscopio nella posizione di contatto del cordone. Successivamente, per associare una cella al contatto del perlina, l'utente fa clic su una posizione all'interno della cella che ha un contatto del cordone. Le informazioni devono essere confermate selezionando AGGIUNGI perlina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67075/67075fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Imaging iniziale di microdomini Ca2+ in cellule T primarie

Local, sub-second Ca2+ signals, termed Ca2+ microdomains, are highly dynamic and short-lived Ca2+ signals, which result in a global [Ca2+]i elevation and ...

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Questo protocollo immagini sia la formazione di sinapsi immunologica che il successivo traffico secretoria polarizzato verso la sinapsi immunologica. I coniugati cellulari si formarono tra una cellula Raji dal polso superantigeno (che fungeva da cellula che presenta l'antigene) e un clone di Jurkat (che fungeva da aiutante echeggiatore del linfocito T).

Immaginare la sinapsi immunologica umana

L'afflusso di calcio, una misura della segnalazione delle cellule T, è un modo efficace per analizzare le risposte alla stimolazione del recettore delle cellule T. Questo protocollo per il multiplexing di Indo-1 con pannelli di anticorpi diretti alle molecole della superficie cellulare sfrutta le capacità altamente flessibili della citometria a flusso a spettro completo.

Analisi dell'afflusso di calcio indotto dal recettore delle cellule T nelle cellule T murine primarie mediante citometria a flusso a spettro completo

Scopri come rilevare i microdomini di Ca²⁺ nelle cellule T primarie murine e umane mediante microscopia a fluorescenza. Questo metodo consente di studiare le vie di segnalazione del calcio nelle cellule immunitarie.

Imaging iniziale di microdomini Ca²⁺ in cellule T primarie

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