Name: Valutazione della citotossicità cellulo-mediata anticorpo-dipendente nelle cellule tumorali utilizzando il biotest del reporter di citotossicità cellulo-mediata anticorpo-dipendente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-13T14:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 21 s
Description: Impara a valutare la citotossicità cellulo-mediata anticorpo-dipendente nelle cellule tumorali utilizzando il biotest ADCC. Questo metodo rapido permette di ottenere risultati accurati in un solo giorno per la ricerca in immunoterapia oncologica.

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<meta charset="utf8"></head><body>Cellule tumorali della tiroide come effettori in un biotest ADCC per l'immunoterapia del cancro

<ol><li>Zahavi, D., AlDeghaither, D., O'Connell, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity%3A+a+strategy+for+improving+antibody-based+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Antib+Ther%22%5BJournal%5D)">Enhancing antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity: a strategy for improving antibody-based immunotherapy.</a> Antib Ther. 1 (1), 7-12 (2018).</li>
<li>Fenis, A., Demaria, O., Gauthier, L., Vivier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+immune+cell+engagers+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">New immune cell engagers for cancer immunotherapy.</a> Nat Rev Immunol. 24 (7), 471-486 (2024).</li>
<li>Pinto, S., Pahl, J., Schottelius, A., Carter, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reimagining+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity+in+cancer%3A+the+potential+of+natural+killer+cell+engagers%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Reimagining antibody-dependent cellular cytotoxicity in cancer: the potential of natural killer cell engagers.</a> Trends Immunol. 43 (11), 932-946 (2022).</li>
<li>Ochoa, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-dependent+cell+cytotoxicity%3A+immunotherapy+strategies+enhancing+effector+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Antibody-dependent cell cytotoxicity: immunotherapy strategies enhancing effector NK cells.</a> Immunol Cell Biol. 95 (4), 347-355 (2017).</li>
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<li>Chung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+in+vitro+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity+activity+of+therapeutic+antibodies+-+impact+of+effector+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterization of in vitro antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity activity of therapeutic antibodies - impact of effector cells.</a> J Immunol Methods. 407, 63-75 (2014).</li>
<li>Shimasaki, N., Jain, A., Campana, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+cells+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">NK cells for cancer immunotherapy.</a> Nat Rev Drug Discov. 19 (3), 200-218 (2020).</li>
<li>Cheng, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+robust+reporter-based+ADCC+assay+with+frozen%2C+thaw-and-use+cells+to+measure+Fc+effector+function+of+therapeutic+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of a robust reporter-based ADCC assay with frozen, thaw-and-use cells to measure Fc effector function of therapeutic antibodies.</a> J Immunol Methods. 414, 69-81 (2014).</li>
<li>Parekh, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+an+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity-reporter+gene+assay%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Development and validation of an antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity-reporter gene assay.</a> MAbs. 4 (3), 310-318 (2012).</li>
<li>Hogarth, P. M., Pietersz, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fc+receptor-targeted+therapies+for+the+treatment+of+inflammation%2C+cancer+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Fc receptor-targeted therapies for the treatment of inflammation, cancer and beyond.</a> Nat Rev Drug Discov. 11 (4), 311-331 (2012).</li>
<li>Chung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+evaluation+of+fucose+reducing+effects+in+a+humanized+antibody+on+Fcgamma+receptor+binding+and+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity+activities%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Quantitative evaluation of fucose reducing effects in a humanized antibody on Fcgamma receptor binding and antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity activities.</a> MAbs. 4 (3), 326-340 (2012).</li>
<li>Promega. ADCC Reporter Bioassay Core Kit Technical Manual. , 
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<li>Miller, A. S., Tejada, M. L., Gazzano-Santoro, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+measuring+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods for measuring antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity in vitro.</a> Methods Mol Biol. 1134, 59-65 (2014).</li>
<li>Lo Nigro, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK-mediated+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity+in+solid+tumors%3A+biological+evidence+and+clinical+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">NK-mediated antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity in solid tumors: biological evidence and clinical perspectives.</a> Ann Transl Med. 7 (5), 105(2019).</li>
<li>Gómez Román, V. R., Murray, J. C., Weiner, L. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aG%C3%B3mez+Rom%C3%A1n%2C+VR+%22Antibody+Fc%22">Antibody Fc</a>. Ackerman, M. E., Nimmerjahn, F. , Academic Press. 1-27 (2014).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0,5% Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td>Diluire 10 volte in PBS per ottenere lo 0,05% di tripsina</td></tr><tr><td>1x Tris Buffer Saline (TBS)</td><td>1st BASE</td><td>BUF-3030-1X1L</td><td>Per il lavaggio della membrana in western blotting</td></tr><tr><td>1,5 M Tris Buffer, pH 8,8</td><td>1st BASE</td><td>BUF-1419-1L-pH8.8</td><td>Per la preparazione del gel SDS</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7522-100ML</td><td>Per la preparazione del campione di Western blotting</td></tr><tr><td>30% soluzione di acrilammide/Bis</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610158</td><td>Per la preparazione del gel SDS</td></tr><tr><td>4x Laemmli Buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610747</td><td>Per la preparazione del campione di western blotting</td></tr><tr><td>Micropiastra in polistirene bianco a 96 pozzetti con fondo piatto trasparente</td><td>Corning Incorporated</td><td>3610</td><td>Per il test</td></tr><tr><td>ADCC Celle effettrici ADCC Bioassay (0,65 mL)</td><td>Promega</td><td>G7011</td><td>Include nel kit di base del saggio biologico reporter ADCC (Promega G7010), 1 x 1 fiala Kit</td></tr><tr><td>centrale di biotest reporter ADCC</td><td>Promega</td><td>G7010</td><td>Menzionato come kit di biodosaggio ADCC per il test ADCC in questo esperimento</td></tr><tr><td>Persolfato di ammonio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678-25G</td><td>Per la preparazione del gel SDS</td></tr><tr><td>Bevacizumab (anticorpo anti VEGF umanizzato)</td><td>MVASI-Uso</td><td></td> <td>come anticorpo di controllo negativo nel test</td></tr> <tr><td>ADCCBHT-101</td><td>Leibniz Institute DSMZ</td><td>ACC279</td><td>Linea cellulare di carcinoma tiroideo papillare anaplastico umano&nbsp;</td></tr><tr><td>Tampone per il saggio della luciferasi Bio-Glo</td><td>Promega</td><td>G7941</td><td>Include nel kit principale del saggio biologico del reporter ADCC (Promega G7010), 1 x 10 mL</td></tr><tr><td>Substrato del saggio della luciferasi Bio-Glo (liofilizzato)</td><td>Promega</td><td>G7941</td><td>Include nel kit principale del saggio del biotest reporter ADCC (Promega G7010), 1 fiala da 1</td></tr><tr><td>raschietto cellulare</td><td>GenFollower</td><td>GD00235</td><td>Per rimuovere la cellula dal pallone di coltura</td></tr><tr><td>Cetuximab (anticorpo chimerico anti-EGFR)</td><td>ERBITUX-Uso</td><td></td> <td>come anticorpo terapeutico nel test ADCC</td></tr><tr><td>Substrato HRP chemiluminescente</td><td>Merck Millipore</td><td>WBKLS0500</td><td>Per la rilevazione di proteine nel western blotting</td></tr><tr><td>Acqua distillata</td><td>Gibco</td><td>15230-162</td><td>Per la preparazione di gel SDS</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>Integratore di terreni di coltura</td></tr><tr><td>Sistema di imaging</td> <td>iBright CL1500Thermo Scientific</td><td>2462621100038</td><td>Per la rilevazione di proteine nel western blotting</td></tr><tr><td>L-glutammina, 200 mM</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>Integratore di terreni di coltura</td></tr><tr><td>Siero a basso contenuto di IgG</td><td>Promega</td><td>G7110</td><td>Include nel kit di base del biotest reporter ADCC (Promega G7010), 1 x 4 mL</td></tr><tr><td>Megafuge 8R</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>42876589 Centrifuge</td></tr><tr><td>Mouse anticorpi monoclonali anti-EGFR</td><td>BD Biosciences</td><td>610016</td><td>Anticorpo primario nel western blotting</td></tr><tr><td>Anticorpi monoclonali anti-VEGFR di topo</td><td>BD Biosciences</td><td>571194</td><td>Anticorpo primario nel</td></tr><tr><td>tampone di dissociazione cellulare non enzimatico</td> Western blotting <td>Sigma Aldrich</td><td>C5789-100ML</td><td>Per la raccolta di cellule dal pallone T75</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>PAN Biotech</td><td>P06-07100</td><td>Antibatterico per terreni di coltura</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), pH 7,2, filtrato sterile</td><td>1st BASE</td><td>CUS-2048-1x1L</td><td>Uso come soluzione di lavaggio per le cellule</td></tr><tr><td>Kit di dosaggio Pierce BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>Per misurare la concentrazione di proteine</td></tr><tr><td>Inibitore della proteasi e della fosfatasi</td><td>Thermo Scientific</td><td>A32959</td><td>Per la digestione delle proteine nella preparazione di campioni per western blotting</td></tr><tr><td>PVDF membrana (Immobilin-P)</td><td>Merck Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>Per il trasferimento di proteine nel western blotting</td></tr><tr><td>Coniglio anti-topo IgG, Fc&gamma; Anticorpo secondario coniugato HRP</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>315-035-046</td><td>Anticorpo secondario in western blotting</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medio</td><td>Capricorn Scientific</td><td>RPMI-XA</td><td>Terreni di coltura cellulare</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Promega</td><td>G7080</td><td>Include nel kit di base del biodosaggio reporter ADCC (Promega G7010), 1 x 36 ml</td></tr><tr><td>di latte scremato in polvere</td><td>Merck Millipore</td><td>70166-500G</td><td>Per il blocco della membrana nel western blotting</td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate</td><td>1st BASE</td><td>BIO-2050-500g</td><td>Per la preparazione del gel SDS</td></tr><tr><td>SW-1736</td><td>Cytion</td><td>300453</td><td>Linea cellulare di cancro a cellule squamose della tiroide umana</td></tr><tr><td>T75 fiasche di coltura</td><td>SPL Lifesciences</td><td>70075</td><td>Pallone per colture cellulari</td></tr><tr><td>Tecan Multimode Reader modello Spark 10M</td><td>Tecan</td><td>1607000294</td><td>per quantificazione della luminicenza</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610801</td><td>Per la preparazione di gel SDS</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Promega</td><td>H5151</td><td>Per il lavaggio della membrana in western blotting</td></tr><tr><td>Vi-cell XR analizzatore di vitalità cellulare</td><td>Beckman Coulter</td><td>AL15072</td><td>Contatore di cellule</td></tr></tbody></table>

valutazione della citotossicità cellulo-mediata anticorpo-dipendente nelle cellule tumorali utilizzando il biotest del reporter di citotossicità cellulo-mediata anticorpo-dipendente

Assessing Antibody-dependent, Cell-mediated Cytotoxicity in Cancer Cells using Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity Reporter Bioassay

L'espressione di EGFR e VEGFR nelle cellule bersaglio BHT-101 e SW-1736 è stata rilevata mediante western blotting. L'espressione di EGFR è stata rilevata in entrambe le cellule BHT-101 e SW-1736, ma non l'espressione di VEGFR (Figura 3).
Utilizzando il kit di biodosaggio ADCC, abbiamo rilevato la reazione ADCC dell'anticorpo anti-EGFR, cetuximab, utilizzando linee cellulari EGFR-positive, BHT-101 e SW-1736, come cellule bersaglio. Il bevacizumab, un inattivatore del VEGF, è stato utilizzato come anticorpo di controllo negativo. Diverse concentrazioni di anticorpi e cellule effettrici sono state incubate con le cellule bersaglio. Il segnale di luminescenza è stato rilevato utilizzando un lettore di piastre (Figura 2). Una maggiore riduzione dell'induzione dell'attività dell'ADCC è stata riscontrata nei gruppi trattati con cetuximab (anticorpi anti-EGFR), ma non è stata osservata alcuna attività dell'ADCC in Bevacizumab (antagonista del VEGF) per entrambe le linee cellulari. Ciò ha dimostrato l'effetto dell'ADCC mirato agli antigeni di membrana extracellulare dell'EGFR per entrambe le linee cellulari. Utilizzando questo metodo, la reazione ADCC è stata convalidata in presenza di Cetuximab in due linee cellulari di carcinoma tiroideo anaplastico (BHT101 e SW1736) (Figura 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67077/67077fig01.jpg"> 
Figura 1: Un diagramma schematico che mostra la reazione dell'ADCC con il kit di biodosaggio ADCC. I siti di legame dell'antigene nell'anticorpo terapeutico si legano agli antigeni di superficie nelle cellule bersaglio. Questo legame porta al legame della porzione Fc dell'anticorpo ai recettori FcƳRIIIa delle cellule effettrici, che sono state geneticamente modificate con NFAT-RE luc, producendo un segnale di luminescenza nelle cellule effettrici. Questa figura è stata modificata dal manuale del kit ADCC Reporter Bioassay Core con il permesso12. Abbreviazioni: ADCC = citotossicità cellulo-mediata anticorpo-dipendente; Fc = regione cristallizzabile del frammento; NFAT = Fattore nucleare della cellula T attivata; RE = Elemento di risposta; luc = Luciferasi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67077/67077fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67077/67077fig02.jpg"> 
Figura 2: Lettura della luminescenza e diagramma sperimentale del design della piastra a 96 pozzetti del sistema di co-coltura ADCC. I segnali di luminescenza vengono letti da un lettore di luminescenza. Fila A: i pozzettida 1 ° a 9contengono il tampone ADCC Bioassay. Fila B: i pozzettida 3 a 8contengono il sistema di reazione ADCC di BHT101 (cellule bersaglio + anticorpo + cellule effettrici). Il 2° pozzetto è senza anticorpi. Il 9° pozzetto contiene solo il tampone ADCC Bioassay. Fila C: i pozzettida 3 a 8contengono il sistema di reazione ADCC di SW-1736 (cellula bersaglio + anticorpo + cellule effettrici). Il 2° pozzetto è senza anticorpi. Il 9° pozzetto contiene solo il tampone ADCC Bioassay. Fila D: i pozzettida 1 ° a 9contengono tampone di saggio. Abbreviazioni: ADCC = citotossicità cellulo-mediata anticorpo-dipendente; AB = tampone per il biodosaggio ADCC; VEGFR = Recettore del fattore di crescita dell'epitelio vascolare; EGFR = Recettore del Fattore di Crescita Epidermico; mAb = anticorpo monoclonale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67077/67077fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67077/67077fig03.jpg"> 
Figura 3: Rilevamento dell'espressione di EGFR e VEGFR nel carcinoma tiroideo BHT-101 e SW-1736 mediante western blotting. L'espressione di EGFR, ma non di VEGFR, è stata rilevata in entrambe le linee cellulari. La b-actina è stata utilizzata come controllo del carico. Abbreviazioni: EGFR = recettore del fattore di crescita epidermico; VEGFR = fattore di crescita vascolare dell'epidermide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67077/67077fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67077/67077fig04.jpg"> 
Figura 4: Induzione del fold dell'attività dell'ADCC. (A) La linea cellulare di carcinoma tiroideo BHT-101 mostra un effetto ADCC in presenza dell'anticorpo anti-EGFR Cetuximab. (B) La linea cellulare di carcinoma tiroideo SW-1736 mostra un effetto ADCC in presenza dell'anticorpo anti-EGFR Cetuximab. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67077/67077fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Valutazione della citotossicità cellulo-mediata anticorpo-dipendente nelle cellule tumorali utilizzando il biotest del reporter di citotossicità cellulo-mediata anticorpo-dipendente

The method for antibody-dependent, cell-mediated cytotoxicity (ADCC) represents an important tool to assess the efficacy of therapeutic antibodies in ...

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Impara a valutare la citotossicità cellulo-mediata anticorpo-dipendente nelle cellule tumorali utilizzando il biotest ADCC. Questo metodo rapido permette di ottenere risultati accurati in un solo giorno per la ricerca in immunoterapia oncologica.

Valutazione della citotossicità cellulo-mediata anticorpo-dipendente nelle cellule tumorali utilizzando il biotest del reporter di citotossicità cellulo-mediata anticorpo-dipendente (Video) | JoVE Journal

Valutazione della citotossicità cellulo-mediata anticorpo-dipendente nelle cellule tumorali utilizzando il biotest del reporter di citotossicità cellulo-mediata anticorpo-dipendente

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