Isolamento, caratterizzazione e analisi proteomica di vescicole extracellulari derivate dal plasma per la scoperta di biomarcatori cardiovascolari

Le vescicole extracellulari circolanti come biomarcatori sono un campo relativamente nuovo nella ricerca sui biomarcatori con un potenziale immenso. Il nostro protocollo mira a fornire un approccio pratico per implementare la scoperta e il rilevamento di biomarcatori legati alle vescicole extracellulari in un pronto soccorso. Prove emergenti hanno dimostrato che il carico molecolare trovato nelle vescicole extracellulari e nella circolazione contiene proteine e RNA di interesse in molteplici contesti patologici.

Diverse nuove vescicole extracellulari, biomarcatori racchiusi, sono stati collegati alla diagnosi e alla prognosi di varie entità di malattie cardiovascolari. Le principali sfide nel campo della scoperta di biomarcatori di vescicole extracellulari circolanti sono la conservazione delle vescicole extracellulari e l'acquisizione del plasma dipendente dalla dinamica di rilascio delle vescicole extracellulari. Pertanto, è necessario un protocollo rigoroso incorporato nella routine clinica per evitare la degradazione delle vescicole extracellulari e mantenere risultati riproducibili, in particolare quando si applicano metodi di analisi su larga scala come la proteomica.

La scoperta di biomarcatori proteici racchiusi all'interno dell'EV circolante dipende fortemente dal momento del prelievo di sangue iniziale rispetto all'insorgenza dei sintomi e dalla durata di conservazione del campione a causa della degradazione naturale dell'EV. Questo protocollo offre un protocollo pratico di isolamento delle EV plasmatiche e l'introduzione nell'analisi proteomica da integrare nel flusso di lavoro clinico di un pronto soccorso. La nostra prossima ricerca si concentrerà sull'integrazione di diversi collettivi di pazienti nella nostra metodologia, tra cui pazienti con insufficienza cardiaca scompensata, aritmie o cardiomiopatia da tachicardia, nonché studi longitudinali su pazienti sottoposti a intervento chirurgico di bypass.

Utilizzando questo protocollo, miriamo a identificare nuovi biomarcatori legati alle vescicole extracellulari che contribuiscono alla diagnosi e alla prognosi delle suddette patologie. Per iniziare a centrifugare il plasma sanguigno umano, utilizzando un'ultra centrifuga con un rotore ad angolo fisso senza rompersi. Dopo che i detriti e il corpo apoptotico si sono depositati, trasferire il surnatante in una nuova provetta e centrifugare a 100.000 G per due ore a quattro gradi Celsius senza rompersi per isolare le vescicole extracellulari.

Rimuovere la provetta con cautela dopo l'ultracentrifugazione. Utilizzando una pipetta elettronica, aspirare delicatamente il surnatante, lasciando circa un millilitro di plasma impoverito di vescicole extracellulari. Passa a una pipetta da 1000 microlitri per pipettare con cura il plasma rimanente senza disturbare il pellet della vescicola extracellulare.

Inclinare gradualmente la provetta durante il pipettaggio per assicurarsi che non rimangano residui di plasma e risospendere il pellet in PBS. Successivamente, diluire la soluzione madre della vescicola extracellulare con PBS ghiacciato a diversi rapporti per ottenere un intervallo di conteggio finale da 10 a 100 nanoparticelle per fotogramma durante il tracciamento. Accendere lo strumento NTA e avviare il software applicabile sul computer collegato.

Inserisci la camera nella bara del laser e fai clic su avvia fotocamera per attivarla. Aspirare un millilitro di PBS in una siringa e collegarla al tubo anteriore. Lavare accuratamente il sistema di tubi, assicurandosi che non rimangano bolle d'aria nella camera.

Monitora la telecamera per rilevare eventuali bolle d'aria o particelle contaminanti. Ora aspirare la diluizione di lavoro della vescicola extracellulare preparata in una siringa da un millilitro e iniettarla nella camera. Vai alle schede di acquisizione ed elaborazione per regolare il guadagno dello schermo in modo che corrisponda alla luminosità del monitor.

Modifica il livello della fotocamera per migliorare la differenziazione delle nanoparticelle sullo schermo. Impostare una soglia di rilevamento appropriata nella scheda del processo per differenziare le particelle dal rumore di fondo. Mettere a fuoco la fotocamera utilizzando la rotella di messa a fuoco su ciascun lato dello strumento fino a quando le nanoparticelle non appaiono nitide sullo schermo.

Dopo aver impostato una temperatura costante di 22 gradi Celsius per tutte le misurazioni nelle impostazioni hardware, fare clic sul pulsante Esegui per avviare la misurazione. Registra almeno tre video di 30 secondi ciascuno per ogni esecuzione del campione. Fare clic su modifica per inserire il fattore di diluizione dei campioni e infine fare clic su Esporta per salvare i risultati.

Utilizzando l'analisi del tracciamento delle nanoparticelle, le vescicole extracellulari sono state identificate e visualizzate in base al brownie e al movimento. L'analisi ha rivelato una concentrazione media di particelle di 1,2 volte 10 alla potenza di 10 particelle per millilitro nel plasma di individui sani, dimostrando la presenza di vescicole extracellulari. La dimensione media delle vescicole extracellulari plasmatiche è stata misurata a 184,7 nanometri, coerente con le dimensioni tipiche delle vescicole extracellulari.