Name: Generazione di organoidi vascolari da cellule staminali pluripotenti indotte dalluomo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-13T13:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 41 s
Description: Scopri un metodo scalabile per generare organoidi vascolari omogenei da cellule staminali pluripotenti umane usando inibitori ROCK e micropozzi. Questo approccio migliora la riproducibilità e supporta la modellazione di malattie vascolari.

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<meta charset="utf8"></head><body>Organoidi vascolari derivati da hiPSC per lo screening di farmaci e la modellazione di malattie

<ol><li>Park, S. E., Georgescu, A., Huh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids-on-a-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organoids-on-a-chip.</a> Science. 364 (6444), 960-965 (2019).</li>
<li>Takebe, T., Wells, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+by+design%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organoids by design.</a> Science. 364 (6444), 956-959 (2019).</li>
<li>Griffith, L. G., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+complex+3d+tissue+physiology+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">Capturing complex 3d tissue physiology in vitro.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 7 (3), 211-224 (2006).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li>
<li>Pasca, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cortical+neurons+and+astrocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+in+3d+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3d culture.</a> Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).</li>
<li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li>
<li>Koike, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+human+hepato-biliary-pancreatic+organogenesis+from+the+foregut-midgut+boundary%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Modelling human hepato-biliary-pancreatic organogenesis from the foregut-midgut boundary.</a> Nature. 574 (7776), 112-116 (2019).</li>
<li>Takebe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularized+and+functional+human+liver+from+an+iPSC-derived+organ+bud+transplant%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant.</a> Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).</li>
<li>Osakada, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+generation+of+rod+and+cone+photoreceptors+from+mouse%2C+monkey+and+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 26 (2), 215-224 (2008).</li>
<li>Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+and+therapeutic+aspects+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Basic and therapeutic aspects of angiogenesis.</a> Cell. 146 (6), 873-887 (2011).</li>
<li>Wimmer, R. A., Leopoldi, A., Aichinger, M., Kerjaschki, D., Penninger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+blood+vessel+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of blood vessel organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 14 (11), 3082-3100 (2019).</li>
<li>Wimmer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+blood+vessel+organoids+as+a+model+of+diabetic+vasculopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human blood vessel organoids as a model of diabetic vasculopathy.</a> Nature. 565 (7740), 505-510 (2019).</li>
<li>He, S., et al. Mapping morphological malformation to genetic dysfunction in blood vessel organoids with 22q11.2 deletion syndrome. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHe%2C+S+%22Biorxiv%22">Biorxiv</a>. , (2021).</li>
<li>He, S., et al. Human vascular organoids with a mosaic akt1 mutation recapitulate proteus syndrome. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHe%2C+S+%22Biorxiv%22">Biorxiv</a>. , (2024).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+polypharmacology+platform+promotes+cytoprotection+and+viability+of+human+pluripotent+and+differentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells.</a> Nat Methods. 18 (5), 528-541 (2021).</li>
<li>Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible%2C+ultra+high-throughput+formation+of+multicellular+organization+from+single+cell+suspension-derived+human+embryonic+stem+cell+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates.</a> PLoS ONE. 3 (2), e1565(2008).</li>
<li>Hwang, Y. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwell-mediated+control+of+embryoid+body+size+regulates+embryonic+stem+cell+fate+via+differential+expression+of+wnt5a+and+wnt11%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Microwell-mediated control of embryoid body size regulates embryonic stem cell fate via differential expression of wnt5a and wnt11.</a> Proc Natl Acad Sci. 106 (40), 16978-16983 (2009).</li>
<li>Antonchuk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+embryoid+bodies+from+human+pluripotent+stem+cells+using+aggrewell+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using aggrewell plates.</a> Methods Mol Biol. 946, 523-533 (2013).</li>
<li>Lippmann, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+blood-brain+barrier+endothelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 30 (8), 783-791 (2012).</li>
<li>Nishihara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+brain+microvascular+endothelial+cell-like+cells+suitable+to+study+immune+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Star+Protoc%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cell-like cells suitable to study immune cell interactions.</a> Star Protoc. 2 (2), 100563(2021).</li>
<li>Qian, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+blood-brain+barrier+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells.</a> Sci Adv. 3 (11), e1701679(2017).</li>
<li>Stebbins, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pluripotent+stem+cell-derived+brain+pericyte-like+cells+induce+blood-brain+barrier+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Human pluripotent stem cell-derived brain pericyte-like cells induce blood-brain barrier properties.</a> Sci Adv. 5 (3), eaau7375(2019).</li>
<li>Campisi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+self-organized+microvascular+model+of+the+human+blood-brain+barrier+with+endothelial+cells%2C+pericytes+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes.</a> Biomaterials. 180, 117-129 (2018).</li>
<li>Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+3D+vascular+and+neuronal+networks+in+a+microfluidic+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Engineered 3D vascular and neuronal networks in a microfluidic platform.</a> Sci Rep. 8 (1), 5168(2018).</li>
<li>Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microphysiological+3D+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+%28ALS%29+from+human+iPS-derived+muscle+cells+and+optogenetic+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons.</a> Sci Adv. 4 (10), eaat5847(2018).</li>
<li>Sakurai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microengineered+vascularized+bleeding+model+that+integrates+the+principal+components+of+hemostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A microengineered vascularized bleeding model that integrates the principal components of hemostasis.</a> Nat Commun. 9 (1), 509(2018).</li>
<li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+a+biomimetic+pericyte-covered+3d+microvascular+network%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Engineering of a biomimetic pericyte-covered 3d microvascular network.</a> PLoS ONE. 10 (7), e0133880(2015).</li>
<li>Kosyakova, N., et al. Differential functional roles of fibroblasts and pericytes in the formation of tissue-engineered microvascular networks in vitro. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKosyakova%2C+N+%22Biorxiv%22">Biorxiv</a>. , (2019).</li>
<li>Whisler, J. A., Chen, M. B., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+perfusable+microvascular+network+morphology+using+a+multiculture+microfluidic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Control of perfusable microvascular network morphology using a multiculture microfluidic system.</a> Tissue Eng Part C Methods. 20 (7), 543-552 (2013).</li>
<li>Haase, K., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+on-chip+vascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Advances in on-chip vascularization.</a> Regen Med. 12 (3), 285-302 (2017).</li>
<li>Wong, K. H. K., Chan, J. M., Kamm, R. D., Tien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+models+of+vascular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Microfluidic models of vascular functions.</a> Annu Rev Biomed Eng. 14 (1), 205-230 (2012).</li>
<li>Boerckel, J. D., Uhrig, B. A., Willett, N. J., Huebsch, N., Guldberg, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+regulation+of+vascular+growth+and+tissue+regeneration+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Mechanical regulation of vascular growth and tissue regeneration in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci. 108 (37), E674-E680 (2011).</li>
<li>Homan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-enhanced+vascularization+and+maturation+of+kidney+organoids+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro.</a> Nat Methods. 16 (3), 255(2019).</li>
<li>Mansour, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+model+of+functional+and+vascularized+human+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids.</a> Nat Biotechnol. 36 (5), 432-441 (2018).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoetanolo (1000x)</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Frammento Asino Anti-Coniglio IgG (H+L)</td><td>Jackson Immuno Research Labs</td><td>711-546-152</td><td>ricostituire con 0,25 mL 50% di glicerolo,&nbsp; conservare a -20 &deg; C per un massimo di 1 anno, rapporto di diluizione per l'uso: 1:1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Frammento Donkey Anti-Goat IgG (H+L)&nbsp;</td><td>Jackson Immuno Research Labs</td><td>705-606-147</td><td>ricostituisce con 0,25 mL di glicerolo al 50%,&nbsp; conservare a -20 gradi C fino a 1 anno, rapporto di diluizione per l'uso: 1:1000</td></tr><tr><td>integratore di B27 meno vitamina A (50x)</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td>scongelare a 4 gradi; C, aliquotare e conservare a -20 gradi C, evitare il ciclo di gelo-disgelo</td></tr><tr><td>BMP4</td><td>ProSpec</td><td>CYT-081</td><td>ricostituire con ddH2O sterile a una concentrazione di 100 ng/&micro; L, aliquotare e conservare a -20 gradi </td></tr><tr><td>C Anticorpo CD31&nbsp;</td><td>abcam</td><td>ab28364</td><td>rapporto di diluizione: 1:400</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>022626001</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Tocris Bioscience</td><td>4423/10</td><td>fare la soluzione madre a 12 mM con DMSO e conservare a -20 &deg; C per un massimo di 1 anno.</td></tr><tr><td>Chroman 1</td><td>Tocris</td><td>7163/10</td><td>rende la soluzione stock a 100 &micro; M con DMSO e conservare a -20 &deg; C per un massimo di 1 anno.</td></tr><tr><td>Collagene I</td><td>Corning</td><td>40236</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Nikon</td><td>AXRMP/Ti2</td><td></td></tr><tr><td>Corning Piastre per elplasia Corning</td><td></td><td>4441</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL contatore di cellule automatizzato</td><td>Thermo Fisher</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, integratore GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>10565018</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, polvere</td><td>Gibco</td><td>12500062</td><td>preparare 10 soluzioni madre con ddH2O biogrado e sterilizzarla con un 0,2 &micro; m filtro. Conservare a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Edi042A</td><td>Cedars Sinai</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Emricasan</td><td>Medchemexpress LLC</td><td>HY1039610MG</td><td>realizzare la soluzione stock a 1 mM con DMSO e immagazzinare a -20 &deg; C per un massimo di 1 anno.</td></tr><tr>Rapporto di diluizione <td>97249</td> <td>dell'anticorpo ERG</td><td>Cell Singali Technology</td><td>: 1:400</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino - Premium</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>scongelamento a 4 gradi; C&nbsp; e aliquota, conservare a -20 &deg; C per un massimo di cinque anni, o conservare a 4 gradi C per un massimo di un mese</td></tr><tr><td>FGF2</td><td>ProSpec</td><td>CYT557</td><td>ricostituire con ddH2O sterile a una concentrazione di 100 ng/&micro; L, aliquotare e conservare a -20 gradi C</td></tr><tr><td>Fluorodish Cell Culture Dish World</td><td>Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1099</td><td>ricostituire con DMSO a una concentrazione di 12 mM, aliquotare e conservare a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Gentamicina (50 mg/mL)</td><td>Gibco</td><td>15710064</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX integratore (100x)</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Eparina, 100</td><td>kU MilliporeSigma</td><td>375095100KU</td><td>ricostituire con ddH2O sterile a una concentrazione di 4 kU/mL</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore</td><td>Thermo Scientific</td><td>13998123</td><td></td></tr><tr><td>Siero Knockout di Ricambio</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td>scongelare a 4 gradi C, aliquotare e conservare a -20 gradi C, evitare il ciclo di gelo-disgelo</td></tr><tr><td>Matrigel, GFR Basement Membrane Matrix</td><td>Corning</td><td>356230</td><td>scongelare a 4 &deg; C, aliquotare e conservare a -80 gradi C, evitare il ciclo di congelamento-scongelamento</td></tr><tr><td>MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali (NEAA, 100x)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Grado di biologia molecolare</td><td>Acqua Corning</td><td>46000CV</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR plus kit</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>1001130</td><td>scongelare a 4 gradi C, aliquotare e conservare a -20 gradi C, evitare il ciclo di gelo-disgelo</td></tr><tr><td>integratore N2 (100x)</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>scongelare a 4 gradi C, aliquotare e conservare a -20 gradi C, evitare il ciclo di congelamento-disgelo</td></tr><tr><td>Soluzione NaOH (1 M)</td><td>Cytiva&nbsp; HyClone</td><td>SH31088.01</td><td></td></tr><tr><td>NeuroBasal medium</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements, ver 5.42</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum</td><td>Jackson Immuno Research Labs</td><td>17000121</td><td>ricostituire con 10 mL di ddH2O sterile, conservare a 4 &deg; C per un massimo di due settimane</td></tr><tr><td>paraformaldeide, 20%</td> <td>Microscopia elettronica Sciences</td><td>15713S</td><td>diluito con PBS</td></tr><tr><td>PBST, 20x</td><td>Thermofisher</td><td>28352</td><td></td></tr><tr><td>PDGFR&beta; anticorpo</td><td>R& Rapporto</td> di diluizione D <td>AF385</td><td>: 1:400</td></tr><tr><td>integratore di poliammine (1000x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8483</td><td></td></tr><tr><td>Reagente chiarificante Rapiclear, 1,49</td><td>SUNJIN LAB</td><td>RC149001</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio (7,5%)</td><td>Gibco</td><td>25080094</td><td></td></tr><tr><td>Sodio desossicolato monoidrato</td><td>Thermofisher</td><td>J6228822</td><td>sciogliere con ddH2O per soluzione madre all'1% (wt/v)</td></tr><tr><td>TBST, 20x</td><td>Thermofisher</td><td>28360</td><td></td></tr><tr><td>trans-ISRIB</td><td>Tocris Bioscience</td><td>5284/10</td><td>rendono la soluzione madre a 1 mM con DMSO e conservano a -20 gradi; C per un massimo di 1 anno.</td></tr><tr><td>Tritin X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain (0,4%)</td><td>Thermo Fisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949-100ML</td><td></td></tr><tr><td>VEGF-A</td><td>ProSpec</td><td>CYT-116</td><td>ricostituire con ddH2O sterile a una concentrazione di 100 ng/&micro; L, aliquotare e conservare a -20 gradi E</td></tr></tbody></table>

generazione di organoidi vascolari da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo

Vascular Organoid Generation from Human-Induced Pluripotent Stem Cells

La Figura 1A presenta lo schema di questo protocollo, compresi i componenti chiave utilizzati in ogni fase. La differenziazione è iniziata con la formazione di EB, seguita dall'induzione del mesoderma e dalla specificazione del lignaggio vascolare (Figura 1B-D). Gli aggregati sono diventati più grandi e meno sferici nel tempo. Gli organoidi hanno iniziato a mostrare spigoli vivi il giorno 5. Dopo essere state incorporate nella miscela di matrice di membrana basale di collagene I, le cellule endoteliali vascolari e i periciti sono germogliati e cresciuti fino a formare reti vascolari complesse già dal 7° giorno (Figura 1E). Poiché lo scopo principale di questo metodo modificato è quello di ridurre al minimo le variazioni tra i diversi lotti di generazione, abbiamo misurato la dimensione EB da due lotti indipendenti e sia le misurazioni dimensionali che l'analisi statistica hanno confermato la coerenza e l'uniformità con questo metodo (Figura 1F).
Per convalidare la differenziazione vascolare, gli organoidi sono stati raccolti il giorno 5 prima dell'inclusione e colorati con marcatori vascolari, tra cui CD31, ERG1 e PDGFRβ. Gli organoidi esprimevano CD31, ERG1 e PDGFRβ (Figura 2), indicando la presenza di cellule endoteliali vascolari e periciti.
Dopo la pulizia dei tessuti, le reti vascolari sono state analizzate con la microscopia a immunofluorescenza a montaggio intero (Figura 3A). Gli organoidi maturi sono stati colorati con CD31, ERG1 e PDGFRβ il giorno 17 (Figura 3B, campione nel blocco di gel) e il giorno 28 (Figura 3C, il campione è stato recuperato dal blocco di gel e dalla coltura singolarmente in una piastra a 96 pozzetti; si noti che la rete vascolare ai bordi ha avvolto gli sferoidi invece di espandersi radialmente dopo essere stati recuperati dal blocco di gel).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67125/67125fig01.jpg"> Figura 1: Generazione di organoidi vascolari. (A) Schema delle fasi e cronologia per la generazione di organoidi vascolari. (B-E) Immagini rappresentative in campo chiaro di organoidi vascolari in diversi stadi. Barre di scala: 100 μm. (F) Analisi statistica in dimensioni EB da due diversi lotti di generazione EB utilizzando il metodo dei micropozzetti presentato in questo lavoro. Per la generazione di EB sono state utilizzate 1.000 celle per micropozzetto e per i lotti 1 e 2, rispettivamente n = 42 e n = 40. La significatività è presentata come ns, non significativa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67125/67125fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67125/67125fig02.jpg"> Figura 2: Immunocolorazione di organoidi vascolari prima dell'inclusione del gel. Immagini fluorescenti rappresentative di organoidi colorati rispettivamente con i marcatori endoteliali (A) CD31 (verde) e (B) ERG1 (verde) e (C) con il marcatore pericitario, PDGFRβ (verde). I nuclei sono stati controcolorati con DAPI (blu). Barre della scala: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67125/67125fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67125/67125fig03.jpg"> Figura 3: Caratterizzazioni in immunofluorescenza della rete vascolare in organoidi vascolari. (A) Un'immagine rappresentativa mostra organoidi vascolari incorporati in gel nella capsula di vetro dopo la pulizia dei tessuti. Gli organoidi erano trasparenti ma visibili sotto una luce UV a 385 nm. (B) Un'immagine 3D rappresentativa a montaggio intero dell'organoide vascolare il giorno 17. L'organoide vascolare è stato colorato con DAPI (blu), il marcatore delle cellule endoteliali vascolari, CD31 (verde) e il marcatore pericitario, PDGFRβ (magenta). (C) Un imaging 3D rappresentativo a montaggio intero di un organoide vascolare recuperato il giorno 28, colorato con i marcatori endoteliali CD31 (rosso) e ERG1 (verde). Barre di scala: 150 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67125/67125fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Mezzo di espansione hiPSC</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr><tr><td>Terreno basale mTeSR Plus</td>
			<td>400 ml</td>
		</tr><tr><td>Supplemento mTeSR Plus</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr><tr><td>Gentamicina (50 mg/mL)</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Composizione del mezzo di espansione hiPSC.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>substrato di semina hiPSC</td>
			<td>20 ml</td>
		</tr><tr><td>Mezzo di espansione PSC</td>
			<td>20 ml</td>
		</tr><tr><td>Cromato 1 (100 μM)</td>
			<td>10 μl</td>
		</tr><tr><td>Emricasan (1 mM)</td>
			<td>30 μl</td>
		</tr><tr><td>Integratore di poliammine (1000x)</td>
			<td>20 μl</td>
		</tr><tr><td>trans-ISRIB (1 mM)</td>
			<td>14 μl</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 2: Composizione del terreno di semina hiPSC.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>N2B27 medio</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr><tr><td>DMEM/F-12, supplemento GlutaMAX</td>
			<td>48,6 ml</td>
		</tr><tr><td>Terreno neurobasale</td>
			<td>48,6 ml</td>
		</tr><tr><td>Integratore GlutaMAX (100x)</td>
			<td>0,5 ml</td>
		</tr><tr><td>Soluzione di aminoacidi non essenziali MEM (NEAA, 100x)</td>
			<td>0,5 ml</td>
		</tr><tr><td>2-Mercaptoetanolo (1000x)</td>
			<td>0,1 ml</td>
		</tr><tr><td>Gentamicina (50 mg/mL)</td>
			<td>0,1 ml</td>
		</tr><tr><td>Integratore N2 (100x)</td>
			<td>0,5 ml</td>
		</tr><tr><td>Integratore di B27 meno vitamina A (50x)</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr><tr><td>Eparina, 4 kU/mL</td>
			<td>0,1 ml</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 3: Composizione del terreno N2B27.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Mezzo di induzione del mesoderma (MIM)</td>
			<td>3 ml</td>
		</tr><tr><td>N2B27 medio</td>
			<td>3 ml</td>
		</tr><tr><td>BMP4 (100 ng/μL)</td>
			<td>0,9 μl</td>
		</tr><tr><td>CHIR99021 (12 mM)</td>
			<td>3 μl</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 4: Composizione del mezzo di induzione del mesoderma (MIM).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Mezzo di differenziazione vascolare 1 (VDM1)</td>
			<td>3 ml</td>
		</tr><tr><td>N2B27 medio</td>
			<td>3 ml</td>
		</tr><tr><td>Forsklin (12 mM)</td>
			<td>0,5 μl</td>
		</tr><tr><td>VEGFA (100 ng/μL)</td>
			<td>3 μl</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 5: Composizione del mezzo di differenziazione vascolare 1 (VDM1).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Miscela di collagene I</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr><tr><td>Collagene I (3,61 g/mL)</td>
			<td>2,77 ml</td>
		</tr><tr><td>10x DMEM/F12 medio</td>
			<td>0,5 ml</td>
		</tr><tr><td>Bicarbonato di sodio, 7,5%</td>
			<td>0,5 ml</td>
		</tr><tr><td>HEPES, 1 M</td>
			<td>0,5 ml</td>
		</tr><tr><td>H2O</td>
			<td>0,73 ml</td>
		</tr><tr><td>NaOH, 1M</td>
			<td>75 μl</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 6: Composizione della miscela di collagene I.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Collagene I - miscela di matrici della membrana basale</td>
			<td>6,5 ml</td>
		</tr><tr><td>Collage I miscela</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr><tr><td>Matrigel (10 mg/mL)</td>
			<td>1,5 ml</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 7: Composizione della miscela di matrice di collagene I-membrana basale.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Mezzo di differenziazione vascolare 2 (VDM2)</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr><tr><td>DMEM/F-12, supplemento GlutaMAX™</td>
			<td>3,67 ml</td>
		</tr><tr><td>Gentamicina (50 mg/mL)</td>
			<td>5 μl</td>
		</tr><tr><td>MEM Soluzione di Aminoacidi Non Essenziali (NEAA, 100X)</td>
			<td>50 μl</td>
		</tr><tr><td>2-Mercaptoetanolo (1000x)</td>
			<td>5 μl</td>
		</tr><tr><td>Eparina, 4 kU/mL</td>
			<td>5 μl</td>
		</tr><tr><td>Sostituzione del siero knockout</td>
			<td>0,75 ml</td>
		</tr><tr><td>FBS</td>
			<td>0,5 ml</td>
		</tr><tr><td>VEGFA (100 ng/μL)</td>
			<td>5 μl</td>
		</tr><tr><td>FGF2 (100 ng/μL)</td>
			<td>5 μl</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 8: Composizione del mezzo di differenziazione vascolare 2 (VDM2).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Buffer di blocco</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr><tr><td>Siero d'asino</td>
			<td>2,5 ml</td>
		</tr><tr><td>Interpolazione 20</td>
			<td>0,25 ml</td>
		</tr><tr><td>Triton X-100</td>
			<td>0,25 ml</td>
		</tr><tr><td>Soluzione di desossicolato di sodio (1%, in peso/v)</td>
			<td>0,5 ml</td>
		</tr><tr><td>PBS</td>
			<td>46,5 ml</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 9: Composizione del tampone bloccante per l'immunocolorazione.

Generazione di organoidi vascolari da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo

Vascular organoids derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) recapitulate the cell type diversity and complex architecture of human ...

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Generazione di organoidi dei vasi sanguigni umani da cellule staminali pluripotenti

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