Name: Valutazione dellattività della DNasi mediante trasferimento di energia di risonanza a fluorescenza raziometrica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 55 s
Description: Impara a valutare l'attività della DNasi mediante un saggio FRET raziometrico sensibile. Questo metodo biochimico consente il monitoraggio in tempo reale dell'attività nucleasica in diverse condizioni sperimentali.

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L'approccio raziometrico della fluorescenza è un metodo analitico che utilizza rapporti di segnali di fluorescenza invece di basarsi esclusivamente sull'intensità di un singolo segnale 1,2. Il vantaggio dell'utilizzo dei rapporti è che forniscono una calibrazione interna e compensano molti fattori casuali, come le variazioni delle concentrazioni del campione e della sonda, i parametri dello strumento, ecc. Ciò migliora l'accuratezza e la sensibilità delle sonde fluorescenti.
Nel contesto specifico delle sonde di trasferimento di energia di risonanza (FRET) di Förster, il termine "raziometrico" si riferisce al fatto che la misurazione si basa sul rapporto di due segnali di emissione provenienti dalla coppia di fluorofori donatori e accettori FRET. Per quantificare l'attività dell'analita target, le sonde FRET raziometriche utilizzano il rapporto tra le intensità di emissione accettore/donatore (o, in alcuni casi, il rapporto donatore/accettore invertito). Il rapporto è direttamente correlato all'efficienza FRET. Fornisce un meccanismo di autonormalizzazione che riduce al minimo il rumore di fondo e tiene conto delle variazioni delle condizioni di illuminazione e della concentrazione della sonda3.
Recenti interessanti applicazioni del metodo raziometrico includono il suo utilizzo in biosensori elettrochimici raziometrici per la rilevazione del DNA tumorale circolante (ctDNA)4,5, in bio-nanomacchine alimentate dal movimento browniano per la rilevazione FRET della fase fagocitaria dell'apoptosi6 e per la marcatura FRET espressa e l'analisi della clearance fagocitaria7. L'approccio raziometrico FRET descritto in questo lavoro è utile per la valutazione quantitativa dell'attività della DNasi. Le misurazioni del saggio si basano sui rapporti delle emissioni della coppia FRET. Grazie alla sua capacità di rilevare anche la scissione minima e lenta del DNA, il test è particolarmente adatto per lo studio di attività nucleolitiche deboli che richiedono periodi di osservazione più lunghi e per esperimenti a diversi livelli di pH.
Qui, alcuni vantaggi specifici del saggio FRET raziometrico sono illustrati dalla sua applicazione per studiare l'attività DNasi di un debole inibitore dell'elastasi nucleasi-leucocita (LEI). Il rapporto include un protocollo dettagliato con istruzioni dettagliate e una descrizione dell'analisi raziometrica dei dati.
Descrizione della sonda FRET raziometrica
La sonda FRET raziometrica è un oligo di DNA autocomplementare a 38 mer che trasporta la coppia FRET donatore-accettore di FAM-TAM (Fluoresceina-Tetrametilrodamina). La sua sequenza è 5'-AAGGGT(TAM) CCTGCTGCAGGACCCTTAACGCATTATGCGT(FAM)T-3'. Il 38-mer auto-ibridante assume una conformazione a forma di graffa, comprendente due forcine collegate di 23 e 15 nucleotidi, che posizionano i suoi due fluorofori a 23,8 Å l'uno dall'altro. Questo è significativamente più vicino del raggio di Förster per questa coppia, R0 = 55 Å8. Tale posizionamento corrisponde ad un'altissima efficienza di trasferimento di energia dal donatore all'accettore7: EFRET = 0,993477. Di conseguenza, quando illuminata alla lunghezza d'onda di eccitazione FAM (488 nm), la sonda FRET emette fluorescenza alla lunghezza d'onda di emissione dell'accettore TAM (580 nm), mentre l'emissione FAM (525 nm) viene soppressa.
La Figura 1A mostra la struttura secondaria della sonda prevista dall'UNAFold, con piccoli anelli su entrambi gli apici delle forcine a causa dell'impedimento sterico dovuto alla curvatura stretta. Lo schema del rilevamento della rottura del DNA da parte della sonda FRET è presentato nella Figura 1B. Mostra che la rottura dell'oligosonda da parte di una DNasi separa la sua coppia FRET. Questa separazione produce drastici cambiamenti negli spettri di emissione di entrambi i fluorofori nella sonda. La Figura 1C presenta gli spettri di emissione della sonda prima e dopo la sua scissione e dimostra che la divisione della coppia FRET dopo la scissione della sonda DNasi II aumenta l'emissione del donatore a 525 nm (ID 525 nm) e contemporaneamente diminuisce l'emissione dell'accettore a 580 nm (IA 580 nm). La Figura 1D mostra i rapporti PAGE, gel e FRET corrispondenti agli spettri di emissione. La scissione della sonda DNasi II ha prodotto due bande larghe corrispondenti a frammenti FAM 12-16-mer (verde) e TAM 20-24-mer (rosso), indicando tagli casuali del 38-mer su entrambi i lati di T23 in prossimità dell'area di connessione tra le forcine.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67134/67134fig1v5.jpg"> 
Figura 1: Struttura e funzionamento della sonda FRET raziometrica. (A) Struttura secondaria prevista della sonda FRET generata da UNAFold. (B) Rappresentazione schematica della sonda FRET funzionante. La sonda FRET raziometrica è un oligonucleotide a forma di graffa a 38 mer marcato con un donatore FRET (FAM) e un accettore (TAM) a una distanza FRET effettiva di 23,8 Å, garantendo un'efficienza FRET del &gt;99%. La scissione dell'oligosonda da parte di una DNasi separa la coppia FRET, abolendo FRET. (C) Spettri di emissione della sonda FRET prima e dopo la scissione mediata da DNasi II. Prima della scissione, l'emissione di FAM viene soppressa e l'emissione di TAM è prominente. La scissione mediata da DNasi separa FAM e TAM, ripristinando l'emissione di FAM (picco di 525 nm) e abolendo l'emissione di TAM (calo di 580 nm). Eccitazione λ = 488 nm. (D) Valutazione raziometrica ed elettroforetica della sonda FRET prima e dopo la scissione della DNasi II. Pannello superiore: rapporti FRET (RD/A = ID 525 nm / IA 580 nm), che rappresentano una misura quantitativa dello stato della sonda. Rosso: non scisso; verde: DNasi II-scissione. Pannello inferiore: Gel denaturante PAGE corrispondente ai dati fluorimetrici. La scissione della DNasi II produce frammenti marcati con FAM (12-16 nt, verde) e frammenti marcati con TAM (20-24 nt, rosso), che indicano la scissione vicino alla connessione tra le forcine, che fiancheggiano T23. Il controllo non scisso mostra una fluorescenza gialla. Scala: oligonucleotidi marcati con FAM e TAM corrispondenti ai segmenti 5' e 3' della sonda 38-mer, con etichette fluorescenti nelle loro posizioni originali. Condizioni di reazione: 10 mM di tampone acetato di sodio (pH 5,2), 1 pmol/μL di sonda FRET, 0,0033 U/μL di DNasi II, 24 ore a 37 °C. RD/A = ID 525 nm/IA 580 nm; Eccitazione λ = 488 nm. UNAFold condizioni: sonda FRET da 1 μM, 10 mM Na+, 0 mM Mg2+, 37 °C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67134/67134fig1v5large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Mentre i cambiamenti negli spettri di emissione dei singoli test sono evidenti, i confronti quantitativi tra un gran numero di spettri di emissione richiedono un parametro quantitativo più facile da usare e compatto. Questo ruolo è svolto dal rapporto FRET. Il metodo di fluorescenza presentato appartiene a un gruppo di approcci raziometrici che si basano sui rapporti diretti (a due canali) delle emissioni di fluorescenza dei membri della coppia FRET per le loro valutazioni quantitative 2,9.
L'approccio utilizza il rapporto tra le emissioni donatore/accettore (RD/A = ID 525 nm / IA 580 nm), che è correlato all'efficienza FRET e caratterizza quantitativamente la condizione del 38-mer (rotto o intatto). Il rapporto ID / IA fornisce un meccanismo di autonormalizzazione che tiene conto intrinsecamente delle variazioni di fattori come la concentrazione della sonda, l'intensità dell'eccitazione e il fotosbiancamento3. L'approccio è adatto solo per sonde FRET che hanno donatore e accettore collegati all'interno della stessa sonda, dove il loro rapporto è noto e costante. Per questo motivo, l'approccio non deve considerare né l'eccitazione diretta dell'accettore né il crosstalk del donatore2. La stechiometria fissa donatore-accettore della sonda assicura che i rapporti di emissione donatore/accettore non siano influenzati da queste variazioni e riflettano direttamente le condizioni della sonda. Di conseguenza, il rapporto tra le emissioni donatore-accettore fornisce un parametro quantitativo di scissione del DNA con normalizzazione del segnale incorporata 2,3.
Il test utilizza il rapporto ID / IA ( piuttosto che l'opposto rapporto IA / ID ) perché questo rapporto descrive la cessazione della FRET dopo la scissione della sonda e quindi cambia nella stessa direzione dell'attività della DNasi, aumentando con l'aumento della scissione. Ciò è illustrato dalla Figura 1D, che mostra il rapporto FRET della sonda raziometrica e la sua elettroforesi PAGE prima e dopo la sua scissione da parte della DNasi II, entrambi corrispondenti agli spettri nella Figura 1C. Per dimostrare la convenienza, l'economicità temporale e la facilità d'uso del test FRET raziometrico, è stato applicato per scoprire e studiare l'attività della DNasi di un debole inibitore dell'elastasi nucleasi-leucociti (LEI).
LEI a nucleasi debole
L'inibitore della proteasi LEI è naturalmente metastabile, cioè topologicamente sbilanciato. Questa caratteristica è essenziale per il suo meccanismo inibitorio. Quando la sua proteasi bersaglio scinde l'ansa del sito reattivo LEI (RSL), la molecola inibitrice della proteasi subisce un drastico cambiamento conformazionale, allungando meccanicamente la proteasi in una forma inattiva10,11. Sorprendentemente, questo rompe e distende anche la molecola stessa del LEI e smaschera un sito criptico della DNasi che è coperto nel suo ripiegamento nativo, convertendo così il LEI in un'endonucleasi attiva L-DNasi II (DNasi II derivata dal LEI)11,12. Il sito criptico della DNasi può anche essere esposto dalla denaturazione e dalla rottura del LEI causata dalla sua incubazione notturna a pH 2 in acido solforico10,13. L'utilizzo di questo test FRET per studiare i LEI ha dimostrato che i trattamenti di denaturazione chimica e la scissione enzimatica mirata non sono strettamente necessari per smascherare l'attività nucleolitica latente dei LEI.
L'applicazione e il protocollo presentati dell'approccio FRET raziometrico descrivono la scoperta di una debole attività della DNasi intrinsecamente presente nel LEI normale e non denaturato. La scoperta della capacità nucleolitica intrinseca del LEI non scisso e la sua analisi sono state possibili grazie all'idoneità del test per lunghi periodi di osservazione a diversi livelli di pH acido.

<table><tbody><tr><td>Piastra a 96 pozzetti</td><td>Falcone</td><td>353219</td><td></td></tr><tr><td>Sonda FRET DNA</td><td>IDT DNA</td><td></td><td>5'-AAG GGT(TAM)CCT GCT GCA GGA CCC TTA ACG CAT TAT GCG T(FAM)T- 3'; FAM &ndash; Fluoresceina-dT; &nbsp; TAM &ndash; Tetrametilrodammina-dT.</td></tr><tr><td>DNasi II</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8764</td><td></td></tr><tr><td>Fotocamera reflex digitale EVOLT</td><td>Olimpo</td><td>E500</td><td></td></tr><tr><td>Apparecchio per elettroforesi su gel con alimentatore</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LEI</td><td>Novoproteina</td><td>CJ01</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di imaging su gel LiCOR</td><td>LiCOR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acqua priva di nucleasi</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>Gel PAGE prefabbricato</td><td>Invitrogen</td><td>EC68852</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione tampone di acetato di sodio pH 5,2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2899-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofluorimetro</td><td>Tecan</td><td></td><td>Saffire 2</td></tr></tbody></table>

valutazione dell'attività della dnasi mediante trasferimento di energia di risonanza a fluorescenza raziometrica

Assessment of DNase Activity by Ratiometric Fluorescence Resonance Energy Transfer

Questo studio rappresentativo evidenzia i vantaggi specifici dell'approccio FRET raziometrico per lo studio delle reazioni enzimatiche lente che richiedono lunghi periodi di osservazione. In particolare, l'applicazione dimostra il rilevamento e l'analisi dell'attività DNase intrinseca del LEI utilizzando un sistema FRET raziometrico. I risultati di questo studio sono mostrati nella Figura 2.
Utilizz...

Valutazione dell'attività della DNasi mediante trasferimento di energia di risonanza a fluorescenza raziometrica

The present protocol describes a simple and sensitive ratiometric F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) assay for the detection and quantitative ...

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