Name: Visualizzazione della risposta al danno al DNA nelle cellule di Purkinje utilizzando colture organotipiche cerebellari (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-27T12:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Scopri la risposta al danno al DNA nelle cellule di Purkinje utilizzando colture organotipiche cerebellari da topi. Questo metodo rivela i meccanismi della degenerazione cerebellare nell'ataxia-telangiectasia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Cellule cerebellari di Purkinje: risposta al danno al DNA in colture organotipiche

<table><tbody><tr><td>Reagente e attrezzature</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>150 x 30 cm Piastra di Petri</td><td>Corning Inc.</td><td>3261</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri 35 x 10 mm</td><td>Corning Inc.</td><td>3294</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270725-1L</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini adesivi per microscopio</td><td>Marienfeld</td><td>48187</td><td>76 x 26 x 1 mm</td></tr><tr><td>Lame per tritatutto</td><td>TED PELLA</td><td>Modello TC752-1</td><td>&nbsp; Stile Lamette da barba</td></tr><tr><td>BME</td><td>GIBCO</td><td>41010-026 500ml.</td><td>Nessun L-Glut</td></tr><tr><td>Inserti per colture cellulari</td><td>Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosio</td><td>biologico Indo.</td><td>02-015-1A</td><td></td></tr><tr><td>HBSS senza rosso fenolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-1138-500L</td><td>No Ca+, No Mg+</td></tr><tr><td>HBSS con rosso fenolo</td><td>Sartorius</td><td>02-015-1A</td><td></td></tr><tr><td>Siero di cavallo&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>26050088</td> pinza per iride <td>inattivata a caldo</td></tr><tr><td></td><td>CellPath</td><td>GZX-0100-00A</td> Spatola per iride <td>seghettata smussata da 130 mm</td></tr><tr><td></td><td>F.S.T</td><td>10092-12</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>41010026</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>322412-1L</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo&nbsp;</td><td>Microscopio Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio senza</td><td>GRIGENE. Ltd, Israele</td><td>K239320A</td><td></td></tr><tr><td>Paraquat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>856177-250MG</td><td>Paraquat dicloruro (metilviologeno)</td></tr><tr><td>PARG- Poli(ADP-Ribosio) Inibitore della glicoidrolasi</td><td>Tocris Bioscience, Regno Unito</td><td>PDD 00017273</td><td>sensibile alla luce&nbsp;</td></tr><tr><td>Tampone fosfato</td><td>Biological Indo.</td><td>02-018-1A</td><td></td></tr><tr><td>Forbici, piastre</td><td></td><td></td><td></td>a</tr><tr><td>sei pozzetti</td><td>per tessuti cutanei Corning incorporati</td><td>CLS3516</td><td></td></tr><tr><td>dischi da taglio di ricambio&nbsp;</td><td>TED PELLA</td><td>Modello 10180-01</td><td></td></tr><tr><td>Tritatessuti</td><td>McIlwain</td><td>Modello TC752</td><td>10180-220</td></tr><tr><td>Pinzette, appuntite</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coppette</td><td></td><td></td><td></td> urinarie</tr><tr><td><forte>Anticorpi</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor 488 asino anti IgG di coniglio</td><td>&nbsp; Invitrogen</td><td>A21206</td><td>1:500; secondario ab; Tampone di diluizione secondario; &nbsp; Incubazione per 2 ore a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Anti protien acido fibrillare gliale</td><td>Milliphore</td><td>MAB3402</td><td>1:1500; ab primario; bloccante; Host: mouse</td></tr><tr><td>Anti-calbindin-D-28K</td><td>Swant&nbsp;</td><td>CB300</td><td>1:2000; ab primario; bloccante; ospite: coniglio&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-calbindina-D-28K</td><td>Swant</td><td>CB-38a</td><td>1:2000; ab primario; bloccante&nbsp;</td></tr><tr><td>Reagente anti-pan-ADP-ribosio</td><td>Milliphore</td><td>MABE1016</td><td>1:800; ab primario; bloccante; incubazione per 2 ore a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidina-2'-fenilindolo dicloridrato)</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>4084</td><td>1:1000; tampone di diluizione secondario; incubazione per 20 minuti a temperatura ambiente</td></tr></tbody></table>

visualizzazione della risposta al danno al dna nelle cellule di purkinje utilizzando colture organotipiche cerebellari

Visualizing the DNA Damage Response in Purkinje Cells Using Cerebellar Organotypic Cultures

La Figura 1 illustra l'aspetto generale delle colture organotipiche cerebellari. La riga superiore della Figura 1A mostra la foliazione cerebellare, che viene mantenuta in coltura, mentre la riga inferiore mostra i PC colorati per la Calbindina D-28k (verde) e i nuclei neuronali colorati per NeuN (rosso). Nella Figura 1B, gli astrociti nei PC (rosso) sono colorati per GFAP (verde), una proteina di tipo III del filamento intermedio. La Figura 2 e la Figura 3 mostrano la colorazione PAR osservata dopo aver trattato queste colture con due agenti dannosi per il DNA, entrambi fortemente ossidanti: bromato di potassio (una concentrazione finale di 10 mM per 12 ore) e paraquat. La risposta PAR è stata marcata nei PC trattati nel foglio cerebellare rispetto al controllo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67167/67167fig01.jpg"> Figura 1: Panoramica delle colture organotipiche cerebellari mure. (A) La riga superiore illustra la foliazione cerebellare, che viene mantenuta in coltura. La riga inferiore si concentra sul livello PC. I PC sono evidenziati da Calbindin D-28k (verde). La colorazione NeuN (rosso) identifica i nuclei neuronali attraverso gli strati. (B) Uno sguardo più da vicino ai PC (rosso). GFAP (verde), una proteina del filamento intermedio di tipo III, che evidenzia gli astrociti. Barre della scala = 968,8 μm (A, riga superiore), 42,1 μm (A, seconda fila), 72,7 μm (B, riga superiore), 18,2 μm (B, seconda fila). Abbreviazioni: PC = celle di Purkinje; GFAP = proteina acida fibrillare gliale; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67167/67167fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67167/67167fig02.jpg"> Figura 2: Colorazione PAR in una fetta cerebellare trattata con bromato di potassio. La fetta cerebellare è stata trattata con bromato di potassio (KBrO3), un potente agente ossidante, a una concentrazione finale di 10 mM per 12 ore. Barre di scala = 775 μm. Abbreviazioni: PAR = poli(ADP-ribosio); DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67167/67167fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67167/67167fig03.jpg"> Figura 3: Risposta PAR in fette cerebellari esposte al paraquat, un forte produttore di anioni superossido. (A) Una visione generale di un foglio cerebellare. Si noti la robusta risposta PAR, in particolare nei PC, rispetto al controllo. (B) Un esame più attento mostra la risposta PAR nei PC e in altri tipi di cellule. Barre della scala = 193,8 μm (A), 18,2 μm (B). Abbreviazioni: PAR = poli(ADP-ribosio); DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67167/67167fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td fo:border="1.5pt solid">Soluzioni e tamponi</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid"></td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Soluzione  </td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">Ingredienti</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Mezzo di dissezione</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">Soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) contenente lo 0,5% di D-glucosio. Aggiungere 0,5 mL di soluzione di D-glucosio al 50% a 50 mL di HBSS senza Mg2+ e Ca2+.</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Terreno di coltura BME</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">Mescolare 100 ml di Basal Medium Eagle (BME) contenente rosso fenolo ma non L-glutammina o HEPES, con 50 ml di HBSS con rosso fenolo, 50 ml di siero di cavallo inattivato termicamente, 2 ml di D-glucosio al 50% e 1 ml di 200 mM di L-glutammina. Miscelare e filtrare attraverso un filtro da 0,22 μm in un ambiente sterile. Conservare a 4 °C</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Soluzione bloccante per immunocolorazione</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">in tampone fosfato 0,1 M: aggiungere 0,5% Triton X-100, 10% siero di capra</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Tampone di diluizione anticorpale secondario</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">tampone fosfato 0,1 M, 0,2% Triton X-100</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Tampone di lavaggio</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">tampone fosfato 0,1 M, 0,2% Triton X-100</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Soluzione fissativa</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">Actenoe:metanolo (1:1 v:v)</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Soluzione di permeabilizzazione</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">tampone fosfato 0,1 M, 1% Triton X-100</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Soluzione DAPI</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">Soluzione madre (2 mg/mL) diluita a 1 μg/mL in 1x PBS</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Tampone fosfato</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">Preparare due anime A e B (vedi sotto). Miscelare le soluzioni secondo i rapporti specificati di seguito per ottenere un tampone fosfato 0,2 M. Quindi diluire la soluzione 0,2M con DDW (1:1) per ottenere un tampone fosfato 0,1 M (soluzione di lavoro).</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">soluzione A (per 0,2 M)</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">12 g di Fosfato di Sodio Monobasico Anidro (Na2HPO4 FW 141.96) 500 mL di DDW</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Soluzione B (per 0,2 M)</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">14,2 g di Sodio fosfato diabasico anidro (Na2HPO4 FW 141.96) 500 mL di DDW</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Soluzioni miscelate per fare 0,2 M</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">Preparare 1 L: 230 mL di soluzione A e 770 mL di soluzione B</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">0,1 M di tampone fosfato</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">Diluire la soluzione miscelata con DDW (1:1)</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Soluzioni e loro composizione.

Visualizzazione della risposta al danno al DNA nelle cellule di Purkinje utilizzando colture organotipiche cerebellari

Cerebellar Purkinje cells (PCs) exhibit a unique interplay of high metabolic rates, specific chromatin architecture, and extensive transcriptional ...

visualizing-dna-damage-response-purkinje-cells-using-cerebellar

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Questo metodo descrive la generazione di organotipica culture cerebellare e l'effetto di alcuni stimoli apoptotici sulla vitalità dei diversi tipi di cellule del cervelletto.

Organotipica Culture cerebellare: sfide apoptotiche e rilevamento

Presentiamo un protocollo che permette di visualizzare e valutare quantitativamente la morfologia dell'albero dendritico delle cellule di Purkinje singole coltivate in culture fetta organotipiche cerebellari. Questo protocollo ha lo scopo di promuovere gli studi sui meccanismi di sviluppo dendritiche delle cellule di Purkinje.

L&#39;analisi di morfologia dendritica delle cellule di Purkinje in Culture Slice organotipiche

Questo video illustra una tecnica per ottenere fette organotipiche cerebellari dal cervello di un cucciolo di topo e coltivare le fette in terreni integrati con nutrienti e fattori di crescita per imitare lo sviluppo cerebellare in vitro. Inoltre, specifiche fette cerebellari vengono trattate con un composto di prova e la capacità neuroprotettiva del composto viene analizzata utilizzando una tecnica di colorazione in immunofluorescenza.

Analisi della sopravvivenza delle cellule di Purkinje in colture organotipiche di fette cerebellari

Lo strato granulare esterno cerebellare è il sito della più grande amplificazione transito nel cervello sviluppo. Qui, vi presentiamo un protocollo di indirizzare la modificazione genetica di questo strato al culmine della proliferazione usando ex vivo elettroporazione e la cultura di fette cerebellare da embrionali Giorno 14 embrioni di pollo.

Ex Cultura Vivo del Chick cerebellare fette e spazialmente mirata elettroporazione di granuli precursori delle cellule

Questo protocollo descrive un metodo semplice per isolare e neuroni di granulo cerebrale primario del mouse (CGNs) da cuccioli di 6-7 giorno vecchio, trasduzione efficiente di CGNs per la perdita e guadagno di funzione studia, la coltura e la modellazione eccitotossicità neuronale indotta da NMDA, basso-potassio-indotta delle cellule morte, danni al DNA e stress ossidativo utilizzando lo stesso modello di cultura.

Modellazione di morte neuronale e degenerazione in neuroni cerebellari del granello primario del Mouse

Qui presentiamo un metodo per preparare organotipiche fetta culture dal cervelletto di topo e guaina mielinica colorazione da immunohistochemistry adatto per studiare i meccanismi della mielinizzazione e remyelination nel sistema nervoso centrale.

Preparazione e Immunostaining di su colture organotipiche Myelinating fetta cerebellare

Le colture di fette organotipiche sono un potente strumento per studiare i processi neurosviluppo o degenerativi/rigenerativi. Qui, descriviamo un protocollo che modella la morte del neurosviluppo delle cellule Purkinje nelle colture di fette di cerebellar di topo. Questo metodo può beneficiare la ricerca nella scoperta di farmaci neuroprotettivi.

Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures

Tecnica necessaria per visualizzare il cuore pulsante di larve e...

Visualizzare il cuore pulsante di Drosophila</em

Questo protocollo dimostra una semplice molecola singola tecnica di microscopia a fluorescenza per la visualizzazione di replicazione del DNA da replisomes singoli in tempo reale.

Visualizzazione singola molecola di DNA replica con microscopia a fluorescenza

Un protocollo dettagliato è descritto per l'imaging in tempo reale la formazione di complessi di riparazione del DNA...

Imaging mismatch repair e risposte cellulari al danno del DNA in Bacillus subtilis</em

Scopri la risposta al danno al DNA nelle cellule di Purkinje utilizzando colture organotipiche cerebellari da topi. Questo metodo rivela i meccanismi della degenerazione cerebellare nell'ataxia-telangiectasia.

Visualizzazione della risposta al danno al DNA nelle cellule di Purkinje utilizzando colture organotipiche cerebellari

Esplora altri video