Name: Analisi metabolomica dellorzo mediante gascromatografia/spettrometria di massa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-08T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Scopri l'analisi metabolomica dell'orzo mediante gascromatografia/spettrometria di massa per studiare gli effetti della siccità sull'agricoltura. Questo metodo migliora l'identificazione dei metaboliti e contribuisce alla sicurezza alimentare.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Il finanziamento è stato fornito dall'USDA ARS Pulse Crop Health Initiative e dalla Idaho Barley Commission.

1. Preparazione dei campioni standard (Figura 2)
<img alt="diagramma della struttura chimica di eptacosano, 5α-colostano-3β-olo, fenil-β-D-glucopiranoside, 4-cloro-L-fenilalanina" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67175/67175fig02.jpg" data-altupdatedat="1788840098000" data-alt="Figura 2"> 
Figura 2: Strutture chimiche dei quattro standard interni utilizzati in questo metodo. Questi quattro standard vengono utilizzati per la semiquantificazione dei metaboliti nelle diverse frazioni dell'orzo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67175/67175fig02large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<ol>
	<li>Preparare lo standard 1 sciogliendo l'n-eptacosano (50 mg, purezza ≥97%) in n-esano (100 mL, purezza ≥95%).</li>
	<li>Preparare lo standard 2 sciogliendo il 5α-colostan-3β-olo (60 mg, purezza ≥95%) in diclorometano (CH2Cl2, 100 mL, purezza ≥99%).</li>
	<li>Preparare lo standard 3 sciogliendo il fenil-β-D-glucopiranoside (80 mg, purezza ≥95%) in acqua deionizzata (H2O dionizzata, 100 mL).</li>
	<li>Preparare lo standard 4 sciogliendo la 4-cloro-L-fenilalanina (40 mg, purezza ≥97%) in H2O dionizzata (100 mL).</li>
</ol>
2. Fraccionamento iniziale
<ol>
	<li>Caricare la farina d'orzo (200 mg) in un serbatoio per estrazione in fase solida (SPE). Ammorbidire la farina con metanolo (200 µL, grado ACS o purezza superiore) per 20 minuti. Rimuovere il metanolo mediante evaporazione sotto vuoto per 30 minuti (Figura 3).</li>
	<li>Dopo l'essiccazione, collegare la colonna a un manifold sotto vuoto. Estrarre i componenti apolari (Frazione A) con CH2Cl2 (4 mL) in un vial da 10 mL ed eseguire il vuoto fino a completa essiccazione della farina.</li>
	<li>Estrarre i componenti polari (Frazione B) aggiungendo una miscela di metanolo e H2O deionizzata (10 mL, 8:2 v/v). Raccogliere in un vial da 10 mL ed eseguire il vuoto fino a completa essiccazione della farina.</li>
</ol>
<img alt="Configurazione del sistema a manifold sotto vuoto per SPE, purificazione del campione, analisi cromatografica in laboratorio." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67175/67175fig03.jpg" data-altupdatedat="1788840098000" data-alt="Figura 3"> 
Figura 3: Configurazione del manifold sotto vuoto. Questa configurazione viene utilizzata per asciugare la farina d'orzo impregnata di metanolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67175/67175fig03large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
3. Elaborazione della frazione A per produrre le frazioni 1 e 2
<ol>
	<li>Aggiungere lo standard 1 e lo standard 2 (100 µL ciascuno) alla Frazione A e mescolare mediante pipettaggio ripetuto. Evaporare completamente il solvente sotto vuoto utilizzando un evaporatore rotante.</li>
	<li>Riportare in soluzione il campione in metil tert-butil etere (MTBE, 500 µL, grado ACS o purezza superiore). Aggiungere metanolo (300 µL) e metossido di sodio (14,6 mg, 97%). Lasciare procedere la transesterificazione per 90 min a temperatura ambiente sotto agitazione magnetica.</li>
	<li>Aggiungere acido cloridrico acquoso (2 mL, 0,35 M, grado ACS o purezza superiore). Mescolare la soluzione acidificata con CH2Cl2 (1 mL). Raccogliere il contenuto della provetta con una pipetta Pasteur lunga e lasciare separare le fasi nella pipetta.</li>
	<li>Trasferire la fase inferiore (organica) in una nuova provetta. Lavare la fase organica aggiungendo acido cloridrico acquoso (2 mL, 0,35 M). Raccogliere il contenuto della provetta con una pipetta Pasteur lunga e lasciare separare le fasi nella pipetta.</li>
	<li>Trasferire la fase inferiore (organica) in una nuova provetta. Evaporare la fase inferiore (organica) a secco su un evaporatore rotante.</li>
	<li>Aggiungere solfato di sodio anidro (200 mg, grado ACS o purezza superiore) a una colonna SPE. Dissolvere il campione ottenuto al passaggio 3.5 in CH2Cl2 (250 µL) e caricare sulla colonna SPE.</li>
	<li>Eluire la Frazione 1 dalla colonna SPE con tre porzioni di n-esano e MTBE (2,04 mL, 50:1 v/v) in una provetta da 10 mL. Evaporare a secco la soluzione contenente la Frazione 1 (FAME e idrocarburi) su un evaporatore rotante. Riportare in soluzione il campione in n-esano (300 µL) e trasferire in una provetta per autosampler per l'analisi in GC/MS.</li>
	<li>Eluire la pre-frazione 2 dalla colonna SPE (dopo l'eluzione della Frazione 1 effettuata al passaggio 3.7) con tre porzioni successive di n-esano e MTBE (2 mL, 7:3 v/v) in una provetta da 10 mL. Evaporare la pre-frazione 2 a secco su un evaporatore rotante.</li>
	<li>Nella stessa provetta, riportare in soluzione la pre-frazione 2 in piridina anidra (250 µL, 99,8%) (trasferire la piridina utilizzando il metodo del palloncino di argon - vedere di seguito) e aggiungere N-metil-N-(trimetilsilil)trifluoroacetammide (MSTFA, 50 µL, grado reagente). 
	NOTA: Tutti i solventi anidri vengono trasferiti utilizzando il metodo del palloncino di argon.
	<ol>
		<li>Utilizzando fascette stringicavo, fissare un guanto in nitrile all'estremità di una siringa priva di stantuffo. Riempire il palloncino con argon anidro e montare un ago monouso sulla siringa.</li>
		<li>Inserire la siringa con il palloncino attraverso il setto della bottiglia contenente il reagente anidro e inserire una seconda siringa con ago lungo per prelevare il solvente (Figura 4).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Spurgare la provetta del campione con un flusso delicato di argon anidro, chiudere con tappo, sigillare con parafilm e porre in un bagno a olio a 70 °C sotto agitazione magnetica per 15 min.</li>
	<li>Al termine della sililazione, raffreddare la Frazione 2 (derivatizzata con TMS: acidi grassi, alcoli grassi, FAME idrossilati, acidi grassi idrossilati, fenoli e steroli) a temperatura ambiente per 5 min. Caricare la Frazione 2 in una provetta per autosampler.</li>
</ol>
<img alt="Impianto con bombola di gas in laboratorio con guanti per la sicurezza, che illustra un esperimento o un apparato per il flusso di gas." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67175/67175fig04.jpg" data-altupdatedat="1788840098000" data-alt="Figura 4"> 
Figura 4: Impianto con palloncino di argon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67175/67175fig04large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
4. Elaborazione della frazione B per produrre le frazioni 3 e 4
<ol>
	<li>Aggiungere gli standard 3 e 4 (300 µL ciascuno) alla Frazione B e miscelare mediante pipettaggio ripetuto. Trasferire 2 mL di questa soluzione in un nuovo vial da processare nella Frazione 3, quindi trasferire 4 mL di questa soluzione in un vial separato da processare nella Frazione 4, a partire dall'evaporazione della pre-frazione 4 al punto 4.4. Evaporare la pre-frazione 3 a secco su un evaporatore rotante, seguita da coevaporazione con piridina anidra (2 x 1,5 mL). 
	NOTA: La coevaporazione viene utilizzata per rimuovere tracce di acqua poiché la piridina anidra forma un azeotropo.</li>
	<li>Riportare in soluzione la pre-frazione 3 in piridina anidra (200 µL) e aggiungere N-trimetilsililimidazolo (TMSIM, 100 µL, 97%). Sfiatare il vial del campione con un flusso delicato di argon anidro, chiudere con tappo, sigillare con parafilm e riscaldare per 20 min in un bagno a olio a 70 °C sotto agitazione magnetica. 
	NOTA: Il TMSIM è un agente sililante mite e sililerà preferenzialmente i gruppi -OH rispetto ai gruppi amminici8.</li>
	<li>Dopo la sililazione, lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente per 5 min, aggiungere n-esano (200 µL) e H2O deionizzata (400 µL) ed agitare. Trasferire la fase superiore organica, cioè la Frazione 3 (zuccheri e polioli derivatizzati con TMS), in un vial per autosampler utilizzando una pipetta Pasteur lunga.</li>
	<li>Evaporare la pre-frazione 4, ottenuta al punto 4.1, a secco su un evaporatore rotante, seguita da coevaporazione con piridina anidra (2 x 1,5 mL). Riportare in soluzione il campione in piridina anidra (250 µL) e aggiungere cloridrato di metossiammina (5 mg, 98%). Sfiatare il vial del campione con argon, chiudere con tappo, sigillare con parafilm e ossimare per 30 min in un bagno a olio a 70 °C sotto agitazione magnetica.</li>
	<li>Lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente per 5 min, aggiungere MSTFA (100 µL), sfiatare delicatamente il vial del campione con argon anidro, chiudere con tappo, sigillare con parafilm e sililare per 20 min in un bagno a olio a 70 °C sotto agitazione magnetica.</li>
	<li>Lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente per 5 min, quindi aggiungere n-esano e H2O deionizzata (800 µL, 5:3 v/v). Raccogliere la fase inferiore (acquosa) utilizzando una pipetta Pasteur lunga e lavare con 4 x 500 µL di n-esano, raccogliendo ogni volta la fase inferiore e scartando quella superiore. Evaporare la fase acquosa a secco su un evaporatore rotante e coevaporare il residuo con acetonitrile anidro (2 x 1,5 mL, grado ACS o purezza superiore).</li>
	<li>Riportare in soluzione il campione in acetonitrile anidro (250 µL) e aggiungere MSTFA (50 µL). Sfiatare delicatamente il vial del campione con argon anidro, chiudere con tappo, sigillare con parafilm e riscaldare per 60 min in un bagno a olio a 70 °C sotto agitazione magnetica.</li>
	<li>Lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente per 5 min, quindi trasferire la Frazione 4 (acidi carbossilici, aminoacidi e ammine derivatizzati con TMS) in un vial per autosampler.</li>
</ol>
5. Metodi GC/MS
<ol>
	<li>Caricare i campioni su un GC/MS con le seguenti caratteristiche della colonna: 15 m x 0,25 mm di diametro interno, rivestita con un film non polare da 0,25 µm.</li>
	<li>Utilizzare i seguenti volumi di iniezione per Frazioni 1-4, rispettivamente: 1,0, 1,0, 0,5 e 0,5 µL. Eseguire i campioni iniettati con un flusso split (rapporto di split 1:10) di 14 mL/min di elio a una temperatura di iniezione di 250 °C.</li>
	<li>Per le Frazioni 1 e 2, aumentare la temperatura della colonna da 100 °C a 300 °C a 4 °C/min con un tempo di mantenimento di 10 minuti. 
	NOTA: Il tempo totale di analisi è di 65 min.</li>
	<li>Per la Frazione 3, riscaldare e mantenere la colonna a 300 °C per tutta la durata dell'analisi. 
	NOTA: Il tempo totale di analisi è di 70 min.</li>
	<li>Per la Frazione 4, riscaldare la colonna da 70 °C a 142 °C a 2,5 °C/min con un tempo di mantenimento di 10 minuti, seguito da un riscaldamento da 142 °C a 235 °C a 4 °C/min con un tempo di mantenimento di 10 minuti. Infine, effettuare un trattamento termico della colonna a 320 °C per 8 minuti. 
	NOTA: Il tempo totale di analisi è di 102 min.</li>
</ol>
6. Identificazione dei metaboliti
<ol>
	<li>Eseguire l'identificazione dei metaboliti confrontando lo spettro di massa di ciascun composto con le librerie spettrali NIST mediante software cromatografico con abbinamento tramite indice di ricerca. Selezionare un picco candidato utilizzando il cursore del computer; quindi, visualizzare gli spettri. Fare clic con il tasto destro sugli spettri per avviare la ricerca nella libreria. 
	NOTA: Questo passaggio può essere automatizzato a seconda del software dello strumento.</li>
	<li>Semiquantificare ogni campione normalizzando le aree dei picchi rispetto allo standard, dividendo l'area del picco del campione per l'area del picco dello standard per ciascuna frazione. 
	NOTA: Questo consente il confronto dei livelli di metaboliti tra frazioni e campioni anche quando la lavorazione dei campioni varia.</li>
</ol>

Derivatization and Separation of Barley Flour Metabolites into Four Fractions

<ol><li>Verstegen, H., Köneke, O., Korzun, V., von Broock, R. The world importance of barley and challenges to further improvements. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVerstegen%2C+H+%22Biotechnological+approaches+to+barley+improvement.+Biotechnology+in+Agriculture+and+Forestry%22">Biotechnological approaches to barley improvement. Biotechnology in Agriculture and Forestry</a>. Kumlehn, J., Stein, N. 69, Springer. Berlin, Heidelberg. 3-19 (2014).</li>
<li>Agribusiness handbook: Barley malt beer. , Agriculture Organization of the United Nations. Rome. 
 <a target="_blank" href="https://www.fao.org/4/i1003e/i1003e00.htm">https://www.fao.org/4/i1003e/i1003e00.htm</a> (2009).</li>
<li>Jena, J., et al. Role of legumes in cropping system for soil ecosystem improvement. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJena%2C+J+%22Ecosystem+services%3A+types%2C+management+and+benefits%22">Ecosystem services: types, management and benefits</a>. , Nova Science Publishers, Inc. New York. 1-21 (2022).</li>
<li>Ahmed, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+changes+in+grain+ultrastructure%2C+amylase%2C+protein+and+amino+acid+profiles+between+Tibetan+wild+and+cultivated+barleys+under+drought+and+salinity+alone+and+combined+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential changes in grain ultrastructure, amylase, protein and amino acid profiles between Tibetan wild and cultivated barleys under drought and salinity alone and combined stress.</a> Food Chem. 141 (3), 2743-2750 (2013).</li>
<li>Marchev, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+and+health%3A+from+nutritional+crops+and+plant-based+pharmaceuticals+to+profiling+of+human+biofluids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Metabolomics and health: from nutritional crops and plant-based pharmaceuticals to profiling of human biofluids.</a> Cell Mol Life Sci. 78 (19-20), 6487-6503 (2021).</li>
<li>Kusch, P. Gas chromatography: Derivatization, sample preparation, application. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKusch%2C+P+%22IntechOpen%22">IntechOpen</a>. , (2019).</li>
<li>Haas, M., Lamour, S., Trapp, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+advanced+derivatization+protocol+for+the+unambiguous+identification+of+monosaccharides+in+complex+mixtures+by+gas+and+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+A%22%5BJournal%5D)">Development of an advanced derivatization protocol for the unambiguous identification of monosaccharides in complex mixtures by gas and liquid chromatography.</a> J Chromatogr A. 1568, 160-167 (2018).</li>
<li>Moldoveanu, S. C., David, V. Derivatization methods in GC and GC/MS. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoldoveanu%2C+SC+%22Gas+chromatography-derivatization%2C+sample+preparation%2C+application%22">Gas chromatography-derivatization, sample preparation, application</a>. , IntechOpen. (2018).</li>
<li>Kim, B. R., Sung, G. H., Kim, J. -J., Yoon, Y. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+development+of+rapid%2C+practical+and+selective+process+for+preparation+of+z-oximes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Korean+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A development of rapid, practical and selective process for preparation of z-oximes.</a> Journal of the Korean Chemical Society. 57 (2), 295-299 (2013).</li>
<li>Miyagawa, H., Bamba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+sequential+derivatization+with+concurrent+methods+for+GC%2FMS-based+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Comparison of sequential derivatization with concurrent methods for GC/MS-based metabolomics.</a> J Biosci Bioeng. 127 (2), 160-168 (2019).</li>
<li>Yi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MeOx-TMS+derivatization+for+GC-MS+metabolic+profiling+of+urine+and+application+in+the+discrimination+between+normal+C57BL%2F6J+and+type+2+diabetic+KK-Ay+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Methods%22%5BJournal%5D)">MeOx-TMS derivatization for GC-MS metabolic profiling of urine and application in the discrimination between normal C57BL/6J and type 2 diabetic KK-Ay mice.</a> Analytical Methods. 6 (12), 4380-4387 (2014).</li>
<li>Röhlig, R. M., Eder, J., Engel, K. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolite+profiling+of+maize+grain%3A+differentiation+due+to+genetics+and+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Metabolite profiling of maize grain: differentiation due to genetics and environment.</a> Metabolomics. 5, 459-477 (2009).</li>
<li>Cook, B. I., Mankin, J. S., Anchukaitis, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Climate+change+and+drought%3A+From+past+to+future%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Climate+Change+Reports%22%5BJournal%5D)">Climate change and drought: From past to future.</a> Current Climate Change Reports. 4, 164-179 (2018).</li>
<li>Samarah, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+drought+stress+on+growth+and+yield+of+barley%5BTitle%5D)+AND+%22Agronomy+for+Sustainable+Development%22%5BJournal%5D)">Effects of drought stress on growth and yield of barley.</a> Agronomy for Sustainable Development. 25 (1), 145-149 (2005).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Riveliamo un metodo di successo per l'estrazione di metaboliti dal chicco d'orzo per l'analisi metabolica. Diversi passaggi di questo protocollo di estrazione richiedono particolare attenzione per ottenere risultati soddisfacenti. Inoltre, è necessario prestare attenzione anche durante la fase di analisi, soprattutto in considerazione del numero e delle diverse proprietà dei prodotti derivatizzati.
Affinché le derivatizzazioni dei metaboliti siano efficaci, è necessario escludere l'umidità dai...

L’orzo è il quarto cereale più prodotto al mondo1. Con il cambiamento climatico che aumenta la frequenza e l’intensità delle siccità, ci si aspetta un calo significativo della produttività di questa coltura, poiché lo stress da siccità grave può ridurre il rendimento del grano di quasi un ordine di grandezza2. Si ipotizza che pratiche agronomiche che diversificano il paesaggio aumentino la resilienza — la tendenza a mantenere i rendimenti e le proprietà del suolo dei terreni coltivati. L’intercoltura, ovvero la coltivazione simultanea di due colture nello stesso campo, è una di queste pratiche, in particolare quando include colture leguminose fissatrici di azoto, come le lenticchie o i piselli3.
I metaboliti vegetali sono piccole molecole presenti nei tessuti e nelle cellule vegetali, come zuccheri, aminoacidi e lipidi, che possono essere utilizzati per comprendere le risposte delle piante allo stress fisico e ambientale. Studi precedenti hanno mostrato che alcuni metaboliti nell'orzo, come la prolina e certi zuccheri, sono presenti a livelli più elevati in condizioni di siccità, ma finora non è stato ancora condotto uno studio metabolomico completo sia per lo stress da siccità sia per le condizioni di coltivazione intercalata4. Resta poco chiaro come il metaboloma del grano cambi a causa dello stress biotico derivante dalla coltivazione intercalata e dello stress ambientale provocato dalla siccità. Il metaboloma — il profilo metabolico totale del grano — è importante sia per le applicazioni finali dell'orzo sia per identificare le risposte biochimiche che consentono alle piante di adattarsi ai cambiamenti del loro ambiente5.
Questo studio descrive lo sviluppo del metodo e i risultati preliminari dell'analisi metabolomica dell'orzo coltivato in condizioni di siccità e di intercoltura, mediante cromatografia gassosa/spettrometria di massa (GC/MS). Ai fini dell'analisi, i metaboliti dell'orzo sono stati frazionati e derivatizzati in base alla polarità in quattro frazioni (Figura 1). I principali costituenti delle frazioni sono i seguenti: Frazione 1: esteri metilici degli acidi grassi (FAME) e idrocarburi; Frazione 2: acidi grassi liberi siliilati, alcoli grassi, FAME idrossilati, fenoli e steroli; Frazione 3: zuccheri e polioli siliilati; e Frazione 4: acidi idrofilici, aminoacidi e ammine siliilati. Pertanto, le Frazioni 1 e 2 contengono prevalentemente metaboliti non polari, mentre le Frazioni 3 e 4 contengono prevalentemente metaboliti polari.
Innanzitutto, i metaboliti vengono estratti dal grano d'orzo macinato mediante solventi polari e apolari. Viene quindi effettuata un'ulteriore frazionamento per consentire una migliore separazione dei metaboliti negli spettri di massa. Inoltre, molti dei metaboliti hanno punti di ebollizione troppo elevati per permettere la volatilizzazione tramite GC, richiedendo un'ulteriore derivatizzazione. Pertanto, i metaboliti contenenti gruppi ossidrilici sono stati silylati formando gli eteri corrispondenti di trimetilsilile (TMS)6, mentre gli esteri degli acidi grassi sono stati convertiti in esteri metilici degli acidi grassi. Inoltre, gli zuccheri sono stati ossimati nella loro forma a catena lineare, riducendo il numero di isomeri possibili per ciascuno zucchero7. Figura 1 mostra uno schema del processo di frazionamento e derivatizzazione dei metaboliti nella farina d'orzo. Il protocollo riportato di seguito fornisce maggiori dettagli sui passaggi specifici illustrati in questa figura.
<img alt="Diagramma di estrazione della farina d'orzo, con dettaglio dei processi di estrazione dei lipidi e dei composti polari." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67175/67175fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788840098000" data-alt="Figura 1"> 
Figura 1: Diagramma di flusso per la frazionatura e la derivatizzazione dei metaboliti dell'orzo. Abbreviazioni: MeOH = metanolo; NaOMe = metossido di sodio; TMSIM = N-trimetilsililimidazolo; MeONH2 = cloridrato di metossiammina; MSTFA = N-metil-N-(trimetilsilil)trifluoroacetammide; DI H2O = acqua deionizzata; MTBE = metil-ter-butil etere; SPE = estrazione in fase solida. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67175/67175fig01largev2.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>4-cloro-L-fenilalanina</td><td>Alfa Aesar</td><td>15470329</td><td>97%</td></tr><tr><td>5&alfa;-colestan-3&beta;-olo</td><td>Sigma</td><td>D6128-10G</td><td>95%</td></tr> <tr><td>Acetonitrile anidro</td><td>Sigma</td><td>360457</td><td>ACS (Essiccato su 3&Aring; setacci molecolari)</td></tr><tr><td>Piridina anidra</td><td>Sigma</td><td>PX2012</td><td>99,8%</td></tr> <tr><td>Solfato di sodio anidro</td><td>EMD</td><td>SX0760-1</td><td>ACS</td></tr><tr><td>Farina d'orzo argon</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Coltivato presso l'Aberdeen Research and Extension Center, Università dell'Idaho</td></tr><tr>Acqua <td></td><td></td><td></td><td>deionizzata</td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>TCI</td><td>D3478</td><td>99%</td></tr> <tr><td>acido cloridrico</td><td>EMD</td><td>HX0603-3</td><td>ACS</td></tr><tr><td>ISQ 7000 spettrometro di massa</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Long Pastuer pipetta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Macron</td><td>3016-16</td><td>ACS</td></tr><tr><td>Metossilamina cloridrato</td><td>Thermo</td><td>A19188.06</td><td>98%</td></tr> <tr><td>Metil terz-butil etere</td><td>VWR</td><td>BDH1139-4LG</td><td>ACS</td></tr><tr><td>n-eptacosano</td><td>Thermo</td><td>L07796.MD</td><td>97%</td></tr><tr><td>n-esano</td><td>Sigma</td><td>HX0295-6</td><td>95%</td></tr><tr><td>N-metil-N-trimetilsilil-trifluoroacetammide</td><td>Restek</td><td>35600</td><td>Reagente</td></tr><tr><td>N-trimetilsiliimidazolo</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12512</td><td>97%</td></tr> <tr><td>fenil-beta;-D-glucopiranoside</td><td>Sigma</td><td>292710-5G</td><td>95%</td></tr> <tr><td>Evaporatore</td><td></td><td></td><td></td>rotante</tr><tr><td>Metossido di sodio</td><td>Merck</td><td>8.06538.0005</td><td>97%</td></tr> <tr><td>Colonna SPE</td><td>Agilent</td><td>12113010</td><td></td></tr><tr><td>SPE Solvente Cartuccia Resevoir Colonna</td><td>Agilent</td><td>12131014</td><td></td></tr><tr><td>TG-SQC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gascromatografo Trace 1300</td><td>Collettore</td> per vuoto ThermoFisher <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analisi metabolomica dell'orzo mediante gascromatografia/spettrometria di massa

Metabolomic Analysis of Barley by Gas Chromatography/Mass Spectrometry

Il cambiamento climatico aumenta il rischio di siccità per l'agricoltura e influisce sia sul contenuto di nutrienti alimentari che sulla sicurezza alimentare complessiva. La metabolomica è un modo per osservare e quantificare gli impatti della siccità sui cereali e su altri prodotti agricoli. I metaboliti identificati possono consentire l'identificazione della risposta biochimica che consente alla pianta di tollerare ambienti stressanti. La metodologia qui presentata ha permesso l'analisi metabolomica totale della farina d'orzo mediante gascromatografia/spettrometria di massa (GC/MS). 
Gli estratti di metaboliti della farina d'orzo sono stati frazionati in quattro frazioni in base alla polarità. Per consentire l'analisi mediante GC/MS, i metaboliti sono stati derivatizzati per aumentare la volatilità e la separazione dei metaboliti: gli esteri degli acidi grassi sono stati derivatizzati in esteri metilici degli acidi grassi; gli zuccheri sono stati ossimati nella loro forma a catena lineare; e i metaboliti con gruppi ossidrilici sono stati convertiti nei loro corrispondenti eteri sililici. I campioni derivatizzati sono stati iniettati nel GC/MS e gli spettri di massa generati sono stati utilizzati per l'identificazione dei metaboliti confrontando gli spettri generati con la libreria di spettri di massa tandem del National Institute of Standards and Technology (NIST). Il metodo qui descritto può essere utilizzato anche per esaminare il metaboloma totale di altre piante, migliorando la nostra comprensione delle risposte biochimiche delle piante stressate.

Il protocollo sviluppato consente con successo la derivatizzazione e la separazione dei numerosi metaboliti presenti nella farina d'orzo. Ciascun picco nel cromatogramma è associato a un composto identificato a partire dai suoi spettri di massa. I tre picchi più prominenti nel Frazione 1 degli esteri metilici dell'acido ottadecadienoico, dell'estere metilico dell'acido esadecanoico e dell'acido ottadecenoico. I tre picchi più prominenti in Frazione 2 degli acidi palmitico, ottadecanoico ...

Viene presentato un metodo per l'analisi metabolomica dell'orzo. Il metodo prevede il frazionamento e la derivatizzazione dei metaboliti e la loro analisi mediante gascromatografia/spettrometria di massa (GC/MS). L'analisi metabolomica può essere utilizzata per determinare l'effetto della consociazione e dello stress da siccità sulla granella.

Analisi metabolomica dell'orzo mediante gascromatografia/spettrometria di massa

Climate change increases drought risk to agriculture and impacts both food nutrient content and overall food security. Metabolomics is one way to observe ...

metabolomic-analysis-of-barley-by-gas-chromatographymass-spectrometry

Research

Ricerca

JoVE Journal

Environment

Ambiente

Il metodo ureasi di preparazione dei campioni per GC / MS dei metaboliti di intermediazione è presentato dal suo inventore. Il metodo permette di one-step di follow-up di screening neonatale per errori congeniti mediante spettrometria di massa tandem dai carboidrati quantificazione, organici e aminoacidi tutti in un unico processo.

One-step Metabolomica: carboidrati, acidi organici e aminoacidi quantificati in una procedura unica

La profilazione dei metaboliti non mirati mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni accoppiata con spettrometria di massa (UPLC-MS) è una tecnica potente per studiare il metabolismo.  Questo articolo descrive un flusso di lavoro tipico utilizzato per la profilazione dei metaboliti non mirati del siero, tra cui l'organizzazione e la preparazione dei campioni, l'acquisizione dei dati, l'analisi dei dati, il controllo di qualità e l'identificazione dei metaboliti.

Su larga scala e non mirato Profiling Metabolomica di siero da Ultra Performance Liquid Chromatography-Spettrometria di Massa (UPLC-MS)

Questo articolo descrive l'applicazione di metabolomica non mirati, trascrittomica e l'analisi statistica multivariata per le trascrizioni di bacche di uva e metaboliti al fine di ottenere una visione nel concetto terroir, vale a dire, l'impatto dell'ambiente sulla caratteristiche qualitative di bacche.

Il concetto Terroir interpretato attraverso uva a bacca Metabolomica e Trascrittomica

Un protocollo migliore è presentato per la misura dell'espressione genica transitoria da costruzioni del reporter in cellule di aleurone di orzo dopo il bombardamento di particelle. La combinazione di grano automatizzato rettifica con analisi dell'enzima piastra a 96 pozzetti fornisce throughput elevato per la procedura.

Espressione genica in strati di Aleurone orzo bombardati con aumento della velocità di misura

Questo protocollo descrive come preparare larve di Drosophila per analisi metabolomica basati su GC-MS.

Preparazione di campioni larvale della drosofila per spettrometria della cromatografia-massa del Gas (GC-MS)-base di metabolomica

L'analisi a livello di sistema di biomolecole multiple è fondamentale per ottenere informazioni funzionali e meccanicistiche sui processi biologici. In questo modo, viene descritto un ampio protocollo per l'estrazione ad alta produttività di lipidi, metaboliti, proteine e amido da un singolo campione raccolto dalla coltura sincronizzata di Chlamydomonas.

Un metodo di estrazione multi-omics per l'analisi approfondita delle culture sincronizzate dell'Alga verde Chlamydomonas reinhardtii

Viene presentato un metodo per l'analisi non mirata di metaboliti e lipidi di grano. Il protocollo include un metodo di estrazione dei metaboliti dell'acetonitricolo e la metodologia di cromatometria liquida-massa di fase invertita, con l'acquisizione in modalità di ionizzazione elettrospray positive e negative.

Analisi metabolomica a base di cromomia liquida non mirata del grano di grano di grano

Presentiamo un protocollo per l'identificazione e la quantificazione delle principali classi di metaboliti idrosolubili nel lievito Saccharomyces cerevisiae. Il metodo descritto è versatile, robusto e sensibile. Permette la separazione di isomeri strutturali e forme stereoisomeriche di metaboliti idrosolubili l'uno dall'altro.

Metabolomica quantitativa di Saccharomyces Cerevisiae mediante cromatografia liquida accoppiata con spettrometria di massa tandem

I protocolli descrivono metodi di cromatografia liquida ad alte prestazioni accoppiati all'indice di rifrazione o al rilevamento spettrometrico di massa per lo studio delle reazioni metaboliche in complessi sistemi privi di cellule a base di lisato.

Cromatografia liquida accoppiata all'indice di rifrazione o al rilevamento spettrometrico di massa per la profilazione dei metaboliti in sistemi privi di cellule a base di lisato

Gas di combustione delle centrali elettriche è una conveniente fonte di CO 2 per la crescita delle alghe. Abbiamo costruito "dei fumi delle alghe coltivazione" prototipo dei sistemi e descritto come scalare il processo di coltivazione algale. Abbiamo dimostrato l'utilizzo di un modello bio-reazione di trasferimento di massa per simulare e progettare il funzionamento ottimale del gas di combustione per la crescita di Chlorella sp. in alghe foto-bioreattori.

Ottimizzare le impostazioni dei gas di scarico per promuovere la crescita di microalghe in fotobioreattori tramite simulazioni al computer

Scopri l'analisi metabolomica dell'orzo mediante gascromatografia/spettrometria di massa per studiare gli effetti della siccità sull'agricoltura. Questo metodo migliora l'identificazione dei metaboliti e contribuisce alla sicurezza alimentare.

Analisi metabolomica dell'orzo mediante gascromatografia/spettrometria di massa

Esplora altri video