Generazione di cellule T regolatorie del recettore dell'antigene chimerico umano

Il nostro laboratorio progetta recettori immunitari artificiali, come i recettori chimerici dell'antigene, e studia come influenzano la biologia delle cellule T regolatorie. Inventando nuove sequenze di DNA e utilizzando modelli murini umanizzati di malattia, miriamo a creare terapie cellulari immunitarie ingegnerizzate per le malattie autoimmuni, il rigetto dei trapianti, il cancro e l'invecchiamento. Quando si progettano recettori chimerici dell'antigene per le cellule T regolatorie, è fondamentale considerare la loro forza.

Le CAR Treg ad alta affinità si comportano più come le cellule T effettrici, producendo un aumento delle citochine infiammatorie e dimostrando una maggiore attività di uccisione. La nostra ricerca in corso indica che la riduzione dell'affinità per le CAR porta a un miglioramento dei profili delle citochine e della funzione nelle CAR Treg. Il campo CAR Treg è nascente e manca di standardizzazione.

Il nostro protocollo introduce un approccio robusto e universale per la generazione e il test delle CAR Treg. Ciò migliora la riproducibilità e accelera l'innovazione, guidando al contempo i laboratori nuovi alla ricerca sulle Treg CAR, soprattutto date le sfide della scarsità di Treg e dei requisiti specializzati. Studiamo i meccanismi che le cellule T regolatorie utilizzano per mantenere l'equilibrio immunitario e promuovere la guarigione dei tessuti.

La nostra ricerca include la comprensione della segnalazione e della funzione delle CAR Treg, nonché l'esplorazione di nuovi contesti patologici in cui la terapia con CAR Treg può offrire benefici unici rispetto alle strategie attuali. Per iniziare, trasferisci il contenuto del leucopak in un tubo conico da 50 millilitri. Aggiungere un volume uguale di DPBS con il 2% di siero fetale bovino e mescolare delicatamente con una pipetta.

Centrifugare il tubo a 300 g per 10 minuti a temperatura ambiente. Una volta aspirato il surnatante, ricostituire il pellet cellulare in due millilitri di DPBS con il 2% di siero fetale bovino. Quindi, aggiungere otto millilitri di soluzione di cloruro di ammonio alla sospensione cellulare e mescolare per inversione delicata.

Con la rottura, centrifugare le cellule lavate a 150 g per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver aspirato il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 30 millilitri di DPBS con il 2% di siero fetale bovino. Quindi, ridurre 10 alla potenza di otto a 10 alla potenza di nove PBMC a 500 g per cinque minuti a temperatura ambiente.

E risospendere in tampone di separazione cellulare a una concentrazione di cinque volte 10 alla potenza di sette cellule per millilitro. Per la selezione cellulare assistita da fluorescenza delle cellule T regolatorie, centrifugare le cellule CD4 positive a 500 g per cinque minuti. Quindi, ricostituire le cellule in 200 microlitri di DPBS.

Per ogni milione di cellule, aggiungere un microlitro di FITC CD4 anti-umano, un microlitro di APC CD25 anti-umano e un microlitro di PE CD127 anti-umano. Dopo aver agitato delicatamente il tubo, mettilo in un frigorifero a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Una volta che le cellule sono state lavate con 10 millilitri di DPBS con siero bovino fetale al 2%, centrifugarle a 500 g per cinque minuti e risospendere delicatamente le cellule colorate a 1,5 volte 10 alla potenza di sette cellule per millilitro in DPBS con siero bovino fetale al 2%. Successivamente, passare la sospensione cellulare colorata attraverso un tappo filtrante da 40 micrometri in provette di smistamento cellulare assistite da fluorescenza.

Preparare provette di raccolta da 15 millilitri contenenti tre millilitri di terreno RPMI10 e metterle sul ghiaccio. Infine, selezionare le cellule T regolatorie CD4 positive, CD25 alte, CD127 negative e CD4 positive, CD25 basse e CD127 positive utilizzando la selezione cellulare assistita da fluorescenza. Per iniziare, prelevare le cellule T regolatorie isolate dal sangue umano 48 ore dopo l'attivazione e risospenderle.

Dopo aver contato le cellule, centrifugare a 500 g per cinque minuti a temperatura ambiente. Risospendere le cellule T regolatorie in RPMI10 a 1,25 volte 10 alla potenza di sei cellule per millilitro con 1.000 unità internazionali per millilitro di interleuchina-2. Ora, aggiungi ogni aliquota di lentivirus a 2,5 volte 10 alla potenza di cinque cellule T regolatorie in 200 microlitri in una provetta da microcentrifuga.

Spinoculato a 1.000 g per un'ora a 32 gradi Celsius. Spostare ogni reazione da 200 microlitri su una piastra da 24 pozzetti. Incubare la piastra con le cellule T regolatorie trasdotte in un incubatore di coltura tissutale per una notte.

Rabboccare ogni pozzetto a due millilitri con terreno RPMI10 con la concentrazione finale di interleuchina-2 di 1.000 unità internazionali per millilitro. Valutare l'efficienza della modifica genica utilizzando la citometria a flusso, come mostrato qui. Per iniziare, assumere cellule T regolatorie risospese con perle anti-CD3 e CD28 in una provetta conica da 15 millilitri 48 ore dopo l'attivazione.

Incubare la sospensione cellulare in un magnete per tre minuti. Mentre sono nel magnete, trasferire le cellule nel mezzo tramite pipetta in una nuova provetta. Dopo la rimozione del cordone, lasciare riposare le cellule T regolatorie debordate in RPMI10 per due ore.

Quindi, centrifugare le cellule T regolatorie a 500 g per cinque minuti. Una volta decantato il surnatante, risospendere le cellule in un terreno di siero ridotto preriscaldato a quattro volte 10 alla potenza di sei cellule per millilitro. Aliquotare le cellule in 100 microlitri in provette da centrifuga da 1,5 millilitri a basso legame proteico.

Aggiungere il virus adeno-associato al recettore dell'antigene chimerico a una molteplicità di infezioni di 20.000 a ciascun campione e risospendere. Quindi, incubare le provette di reazione nell'incubatore per colture tissutali per un'ora. Durante l'incubazione, preparare complessi ribonucleoproteici CRISPR-Cas9 aggiungendo 8,3 microlitri di proteina Cas9 a 2,5 microlitri di RNA guida singola, mirando al locus del gene traccia.

Dopo aver mescolato accuratamente i componenti, incubare la miscela di ribonucleoproteine per 15 minuti a 37 gradi Celsius nell'incubatore di coltura tissutale. Quindi, riempire una nuova provetta per elettroporazione con tre millilitri di tampone per elettroporazione ad alta osmolarità. Inserire il tubo di elettroporazione riempito nella stazione di pipettatura del sistema di elettroporazione fino a quando non si sente un clic.

Impostare le condizioni di elettroporazione su 2, 200 volt, 20 millisecondi, un impulso nel sistema di elettroporazione. Al termine dell'incubazione di un'ora con il virus adeno-associato, centrifugare le cellule con il virus a 300 g per cinque minuti a temperatura ambiente. Una volta aspirato il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 100 microlitri del tampone di risospensione cellulare fornito dal sistema di elettroporazione per campione.

Quindi, aggiungere 10,8 microlitri di complesso ribonucleoproteico per campione e mescolare bene con una pipetta senza creare bolle. A questo punto, inserire un puntale per elettroporazione da 100 microlitri spingendo la pipetta fino al secondo arresto per aprire il morsetto. Posizionare la testa superiore della pipetta nel puntale di elettroporazione finché il morsetto non si innesta saldamente con lo stelo di montaggio del pistone.

Rilasciare gradualmente il pulsante mantenendo la pressione verso il basso sulla pipetta per assicurarsi che il puntale aderisca perfettamente senza spazi vuoti. Quindi, premere la pipetta fino al primo arresto e immergere la punta di elettroporazione nella miscela di ribonucleoproteine cellulari. Estrarre delicatamente il campione nella pipetta senza bolle.

Inserire verticalmente la pipetta con la punta di elettroporazione montata contenente il campione nel tubo E fino a quando non si sente un clic. Dopo aver confermato le impostazioni ottimali per le cellule T regolatorie umane, premere Start sul touchscreen per elettroporare le cellule. Attendi il completamento della visualizzazione del touchscreen.

Rimuovere delicatamente la pipetta e trasferire immediatamente il campione nella piastra a sei pozzetti preparata contenente 2,5 millilitri di terreno RPMI10 preriscaldato privo di antibiotici con interleuchina-2 per pozzetto. Dopo aver fatto oscillare delicatamente la piastra con movimenti lineari, posizionarla nell'incubatore per colture tissutali. Il giorno successivo, da 16 a 18 ore dopo, sostituire il terreno con un terreno contenente antibiotici.

Contare le cellule T regolatorie elettroporate e la coltura a 10 alla potenza di sei cellule per millilitro con 1.000 unità internazionali per millilitro di interleuchina-2.