Name: Microfluidica nella valutazione della funzione piastrinica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-08T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Scopri la valutazione della funzione piastrinica con dispositivi microfluidici per simulare condizioni fisiologiche di flusso ematico. Questo metodo migliora le strategie di emostasi e medicina trasfusionale.

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Tutte le ricerche sono state condotte nel rispetto delle linee guida istituzionali. È stata ottenuta l'approvazione dall'Ufficio per la protezione della ricerca umana dell'Università di Pittsburgh ed è stato ottenuto il consenso informato da volontari umani sani.
1. Preparazione del dispositivo microfluidico
<ol>
	<li>Per fabbricare la parte PDMS del dispositivo, preparare uno stampo master utilizzando l'ottone tramite microlavorazione a controllo numerico computerizzato (CNC). NOTA: A seconda delle dimensioni del canale, le tecniche di fotolitografia possono essere utilizzate per creare uno stampo master. Il dispositivo utilizzato in questo protocollo include otto canali paralleli microlavorati di circa 480 μm di larghezza, 140 μm di altezza all'ingresso e all'uscita del dispositivo e 40 μm di altezza alla stenosi del dispositivo, con una lunghezza della rampa da/verso la regione stenotica di circa 0,3 mm. La lunghezza dei canali è di circa 6 mm.</li>
	<li>Con uno stampo master ottenuto, versare la Base in Elastomero Siliconico (ottenuta dal kit di elastomeri) in un piatto di pesatura. Aggiungere l'agente indurente siliconico (ottenuto dal kit di elastomeri), che facilita la reticolazione delle catene del polimero siliconico per trasformare il PDMS liquido in un solido durevole e flessibile, in un rapporto di 10:1 (agente di base) e mescolare bene la miscela.</li>
	<li>Mettere lo stampo in una capsula di Petri e versare il PDMS non polimerizzato sullo stampo. Mettere la capsula di Petri all'interno di un essiccatore sottovuoto per 30 minuti per rimuovere le bolle.</li>
	<li>Terminare l'indurimento del PDMS nello stampo master mettendolo in forno a 70 °C per 90 minuti.</li>
	<li>Dopo la completa polimerizzazione PDMS, ritagliare il calco microfluidico utilizzando una lama di rasoio o un bisturi. Praticare dei fori ai bordi dei canali (1,5 mm di diametro su entrambi i lati).</li>
	<li>Utilizzando del nastro adesivo da laboratorio, pulire la superficie di un vetrino e il lato inciso del calco microfluidico. Utilizzare aria compressa secondo necessità per rimuovere i detriti rimanenti.</li>
	<li>Posizionare il vetrino e il calco microfluidico con il lato inciso verso l'alto in un pulitore al plasma. Avviare la pompa del vuoto, sigillare la camera e accendere il pulitore al plasma al massimo. Lasciare il vetrino e il PDMS nel pulitore al plasma per 30 s, quindi spegnere il pulitore al plasma e rimuovere l'aspirapolvere.</li>
	<li>Unire il cast pulito al plasma e il vetrino premendo delicatamente i lati rivolti verso l'alto nel pulitore al plasma. Quindi, posizionare il dispositivo microfluidico in un forno/piastra a 70 °C per 10 minuti. NOTA: Non applicare troppa pressione quando si incollano insieme il cast e il vetrino in quanto ciò potrebbe portare a una perdita della morfologia del canale.</li>
	<li>Sciacquare ogni camera con 10-30 μL di etanolo al 70% per sterilizzare e lasciare asciugare il dispositivo microfluidico su una piastra riscaldante a 70 °C. NOTA: I dispositivi devono essere realizzati con almeno 24 ore di anticipo, ma possono essere realizzati con settimane o mesi di anticipo. I dispositivi devono essere conservati in un contenitore ermetico o in una capsula di Petri coperta a temperatura ambiente.</li>
	<li>Il giorno prima della sperimentazione con il dispositivo microfluidico, risciacquare nuovamente ogni camera con 10-30 μL di etanolo al 70% per sterilizzare e lasciare asciugare il dispositivo microfluidico su una piastra riscaldante a 70 °C.</li>
	<li>Rivestire la camera con il reagente di collagene fibrillare equino di tipo 1 (1 mg/mL), diluito in NaCl allo 0,9% in un rapporto volumetrico 1:5 attraverso un'uscita designata all'ingresso designato. Assicurarsi che la direzionalità sia conservata all'interno di un esperimento. Conservare il dispositivo in un contenitore chiuso caldo e umido per evitare l'evaporazione del collagene rivestito all'interno del canale.</li>
	<li>Dopo 1 ora, risciacquare con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per eliminare la soluzione di collagene. Sciacquare nella direzione opposta al rivestimento. Quando non è in uso, conservare nuovamente il dispositivo in un contenitore caldo, umido e chiuso.</li>
</ol>
2. Preparazione del campione di sangue
<ol>
	<li>Ottenere un campione di sangue intero citrato tramite venipuntura. Incubare il sangue intero citrato con una soluzione bloccante del recettore FC (1:600). NOTA: I campioni di sangue vengono conservati a temperatura ambiente prima e durante la sperimentazione.</li>
	<li>Incubare sangue intero citrato con anticorpo CD41 coniugato a fluorescenza (utilizzando un fluoroforo a scelta) (1:600). Macchiare per 30 minuti su un rocker nutante.</li>
	<li>Come controllo positivo per l'inibizione piastrinica, aggiungere Ticagrelor, un antagonista del recettore P2Y12 ricostituito in una soluzione di 2-idrossipropil-β-ciclodestrina al 30% p/v (HP-β-CD) in PBS. NOTA: Prima della sperimentazione devono essere preparate le scorte di Ticagrelor fino a 6,4 mM e può essere effettuata un'ulteriore diluizione delle scorte di Ticagrelor in soluzione di HP-β-CD (30% di HP-β-CD disciolto in PBS) (si raccomandano concentrazioni di 1.000 volte).</li>
	<li>Incubare il campione citrato con Ticagrelor (concentrazione finale fino a 6,4 μM) per 30 minuti per osservare l'inibizione piastrinica.</li>
	<li>Se si mescola l'emoderivato con il campione cittrato, colorare l'emoderivato con una soluzione bloccante del recettore FC (1:600) e un anticorpo CD41 coniugato con fluorescenza (utilizzando un fluoroforo separato e distinto dal campione citato) (1:600).<ol>
		<li>Miscelare un equivalente volumetrico delle unità di prodotto trasfuse con il campione cittrato. Ad esempio, per simulare 2 unità di prodotti piastrinici trasfusi in una persona in emorragia (circa 250 ml per prodotto in un volume ematico totale di 5.000 ml), mescolare 100 μl di emoderivato in 1.000 μl di campione di sangue cittrato.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Immediatamente prima dell'esperimento, filtrare il campione di sangue attraverso un filtro da 40 μm in una provetta sterile da microcentrifuga da 1,5 ml.</li>
</ol>
3. Test di funzionalità piastrinica sotto flusso (Metodo 1)
<ol>
	<li>Accendere il microscopio e il software associato.</li>
	<li>Impostare un livello della pompa della siringa di estrazione con il tavolino del microscopio. Regolare le impostazioni sulla pompa a siringa.<ol>
		<li>Calcolare una portata volumetrica (Q) per una velocità di taglio media desiderata (γ) di 3.500 s-1 nella regione stenotica del canale utilizzando le equazioni (1) e (2)21. 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67214/67214eq01.jpg" style="margin: auto;">(1) 
		<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67214/67214eq02v2.jpg" style="margin: auto;">(2) Dove A è l'area della sezione trasversale del canale, P è il perimetro bagnato, λ è il fattore di forma, b è il lato corto del rettangolo (altezza) e a è il lato lungo del rettangolo (larghezza). NOTA: Il valore di 3.500 s-1 è scelto a causa del taglio critico VWF ed è nel regime arterioso 7,22,23.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Posizionare il dispositivo microfluidico sul tavolino del microscopio. Fissare i bordi del dispositivo microfluidico al tavolino per evitare movimenti. Assicurarsi che l'uscita sia rivolta verso il retro del microscopio.</li>
	<li>Collegare un'estremità di un tubo con diametro interno da 1/16" (lungo circa 30 cm) a un connettore a gomito e l'altra estremità a una siringa da 10 ml con connettore con diametro interno da 1/16".</li>
	<li>Riempire la siringa con PBS sterile e collegarla alla pompa a siringa.</li>
	<li>Posizionare il connettore a gomito nella presa del dispositivo.</li>
	<li>Preparare linee di ingresso lunghe circa 10 cm con il connettore a gomito su un'estremità e il taglio angolato sull'altra estremità.</li>
	<li>Collegare il connettore a gomito di ingresso all'ingresso del dispositivo.</li>
	<li>Posizionare la linea di ingresso in una provetta per microcentrifuga di scarto su un supporto angolato.</li>
	<li>Utilizzare l'obiettivo 10x per dimensioni del canale di circa 500 μm di larghezza e concentrarsi sui bordi del canale del dispositivo microfluidico.</li>
	<li>Adescare le linee con PBS e liberare il canale da eventuali PDMS/detriti facendo avanzare manualmente la pompa a siringa. Assicurati di controllare vicino all'ingresso e all'uscita del canale.</li>
	<li>Aprire le impostazioni di acquisizione delle immagini salvate o creare una procedura di acquisizione delle immagini per le serie temporali acquisite ogni 1-2 s con un canale di campo chiaro e canali fluorescenti corrispondenti agli anticorpi fluorescenti CD41 utilizzati nel campione di sangue.</li>
	<li>Ottenere il campione di sangue citrato filtrato e mescolarlo pipettandolo su e giù appena prima dell'esperimento. Posizionare il campione sul supporto angolato per microcentrifuga.</li>
	<li>Posizionare la linea di ingresso nel campione.</li>
	<li>Avvia la registrazione dell'acquisizione dell'immagine.</li>
	<li>Lentamente, estrarre la siringa per riempire il volume morto nel tubo. Una volta che il sangue raggiunge il canale, premere immediatamente play sulla pompa a siringa per riprendere il flusso alla velocità di taglio desiderata.</li>
	<li>Regolare la messa a fuoco se necessario.</li>
	<li>Eseguire l'esperimento fino a quando le piastrine non hanno completamente occluso la regione stenotica del dispositivo microfluidico o fino a un punto finale sperimentale (cioè 10 minuti).</li>
	<li>Assicurarsi che il tubo di ingresso sia immerso nel campione di sangue per tutta la durata dell'esperimento.</li>
	<li>Una volta completato l'esperimento, interrompere l'acquisizione dell'immagine e arrestare la pompa a siringa. Salva l'acquisizione dell'immagine.</li>
	<li>Rimuovere il connettore a gomito di ingresso e svuotare il contenuto del tubo in un conico di scarico. Svuotare anche il contenuto della siringa e le linee di uscita nei rifiuti conici.</li>
	<li>Sostituire i connettori di ingresso e di uscita e i tubi, se necessario, per i campioni successivi.</li>
</ol>
4. Test di funzionalità piastrinica sotto flusso con campioni a basso volume (inferiori a 1 mL) (Metodo 2)
<ol>
	<li>Ripetere i passaggi da 1.1 a 1.4 come sopra.</li>
	<li>Perforare un'uscita di 1,5 mm di diametro e un'entrata di 3 mm di diametro ai bordi dei canali.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 1.6 a 3.6 come sopra.</li>
	<li>Utilizzare l'obiettivo 10x per dimensioni del canale di circa 500 μm di larghezza e concentrarsi sui bordi del canale del dispositivo microfluidico.</li>
	<li>Liberare il canale da eventuali PDMS/detriti facendo avanzare manualmente la pompa a siringa e allontanando il fluido di accesso con una salvietta da laboratorio. Rimuovere eventuali detriti con del nastro adesivo da laboratorio sulla parte superiore del dispositivo microfluidico.</li>
	<li>Far avanzare manualmente la pompa per riempire il serbatoio di ingresso da 3 mm con PBS.</li>
	<li>Aprire le impostazioni di acquisizione delle immagini salvate o creare una procedura di acquisizione delle immagini per le serie temporali acquisite ogni 1-2 s con un canale di campo chiaro e canali fluorescenti corrispondenti agli anticorpi fluorescenti CD41 utilizzati nel campione di sangue.</li>
	<li>Avviare l'estrazione della pompa a siringa (manualmente o con la velocità impostata) e una volta che il PBS avanza nel canale e la linea di riempimento nel serbatoio sta scendendo, mettere in pausa l'estrazione della pompa.</li>
	<li>Rimuovere il PBS in eccesso dal serbatoio con una pipetta.</li>
	<li>Avvia l'acquisizione dell'immagine.</li>
	<li>Pipettare il campione di sangue nel serbatoio (circa 40 μL) e avviare immediatamente la siringa di prelievo. Assicurati che il flusso inizi. NOTA: Se il motore della pompa a siringa per l'estrazione non è stato innescato al passaggio 4.8, il flusso non si avvierà immediatamente e l'esperimento deve essere ripetuto.</li>
	<li>Riempire il serbatoio di sangue per tutta la durata dell'esperimento, assicurandosi che nessuna sacca d'aria entri nel canale.</li>
	<li>Eseguire l'esperimento fino a quando le piastrine non hanno completamente occluso la regione stenotica del dispositivo microfluidico o fino a un punto finale sperimentale (cioè 10 minuti).</li>
	<li>Una volta completato l'esperimento, interrompere l'acquisizione dell'immagine e arrestare la pompa a siringa. Salva l'acquisizione dell'immagine.</li>
	<li>Rimuovere il sangue in eccesso nel serbatoio mediante pipettaggio. Svuotare il contenuto del tubo di prelievo in un tubo conico di scarico.</li>
	<li>Sostituire i connettori e i tubi, se necessario, per i campioni successivi.</li>
</ol>
5. Decontaminazione
<ol>
	<li>Eliminare le linee di ingresso e uscita dal sangue versandolo in una soluzione di candeggina al 10%.</li>
	<li>Se sono stati utilizzati tutti i canali del dispositivo microfluidico, gettare il dispositivo nel contenitore dei rifiuti a rischio biologico Sharps. NOTA: Tutti i rifiuti biologici devono essere smaltiti in modo appropriato nei rifiuti a rischio biologico.</li>
</ol>
6. Analisi delle immagini
<ol>
	<li>Esporta le immagini dagli esperimenti cinetici utilizzando il software facendo clic su File | Esportazione/Importazione | Esporta.</li>
	<li>Seleziona i seguenti parametri: tipo di file: Tagged Image File Format (TIFF); compressione: LZW; controllare i dati originali e il pixel di spostamento; deselezionare Applica curva di visualizzazione e colore del canale; selezionare Definisci sottoinsieme (regione, regione rettangolare e selezionare l'area del canale con una misura di conservazione della larghezza e dell'altezza tra le condizioni). Esporta nella cartella desiderata e seleziona Crea cartella.</li>
	<li>Notare i seguenti valori sperimentali sul software: frame iniziale quando il sangue entra nel canale; frame rate (Info, Serie Storiche).</li>
	<li>Misurare l'intensità di fluorescenza media normalizzata di ciascun fotogramma in un esperimento utilizzando il codice Matlab fornito come file supplementare 1, modificando i seguenti input per ogni esperimento: fotogramma iniziale/fotogramma finale in base alla lunghezza dell'esperimento (assicurarsi che la lunghezza dell'esperimento sia conservata tra le condizioni); nome dell'esperimento/nome della cartella; ritaglio dei parametri X, Y, H e W. Eseguire il codice una volta per il canale fluorescente piastrinico ricevente e una volta per il canale fluorescente piastrinico del prodotto. Riportare i valori MFI normalizzati (colonna 2) e AUC normalizzati (normalizzati al frame iniziale). Sottrarre il valore della lunghezza dell'esperimento dal valore dell'AUC normalizzato.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Piattaforma per la valutazione della funzione piastrinica in traumi e trasfusioni

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<li>Sorrells, M. G., Neeves, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+and+absorption+of+collagen+peptides+to+polydimethlysiloxane+and+its+influence+on+platelet+adhesion+flow+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">Adsorption and absorption of collagen peptides to polydimethlysiloxane and its influence on platelet adhesion flow assays.</a> Micromachines. 11 (1), 62(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer</td><td>Zeiss</td><td>491917-0001-000</td><td></td></tr><tr><td>Bel-Art Space Saver Vacuum Desuggorss</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-594-15A</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Isotemp Digital Hotplate Stirrer</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB30786161</td><td></td></tr><tr><td>Nutating Mixer</td><td>Fischer Scientific</td><td>88-861-043</td><td></td></tr><tr><td>OHAUS Scout Balance Scale Uline</td><td></td><td>H-5852</td><td></td></tr><tr><td>Forno</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-103-0520</td><td></td></tr><tr><td>Pulitore al plasma</td><td>Harrick</td><td>PDC-32G (115V)</td><td></td></tr><tr><td>Pompa a siringa (PHD ULTRA CP, I/W PROGRAMMABILE)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>883015</td><td></td></tr><tr><td>Zen 3.4</td><td>Zeiss</td><td>Blue edition</td><td>Software</td></tr><tr><td><forte>Materiale</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1/16 pollici ID - Connettori a gomito spinato</td><td>Qosina</td><td>11691</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 10 ml</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-955-459</td><td></td></tr><tr><td>2-idrossipropil-beta;-ciclodestrina</td><td>Cayman Chemicals</td><td>16169</td><td>30% disciolto in soluzione salina tamponata con fosfato</td></tr><tr><td>filtri da 40 micron</td><td>Fischer Scientific</td><td></td><td></td>NC1469671</tr><tr><td>Anticorpo CD41</td><td>Novus Biologicals</td><td> NB100-2614</td><td>Rapporto 1:600 in sangue intero</td></tr><tr><td>Reagente di collagene Chrono-Par</td><td>Chrono Log Corporation</td><td>385</td><td>Rapporto 1:5 in microscopia elettronica salina allo 0,9%</td></tr><tr><td>Punzone per biopsia Miltex con stantuffo, 3,0 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0856599</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Pipetta per microcentrifuga con tappo a scatto SafeLock Tubes, 1,5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-402-25</td><td></td></tr><tr><td>Essendant 121oz. Clorox Candeggina germicida</td><td>Fischer Scientific</td><td>50371500</td><td></td></tr><tr><td>etanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-678-005</td><td>70%</td></tr> <tr><td>Sicurezza del falco Dust Off DPSXLRCP Gas compresso</td><td>Supra</td><td>1381978</td><td></td></tr><tr><td>Human TruStain</td><td>Biolegend</td><td>422302</td><td>Rapporto 1:600 nel sangue intero</td></tr><tr><td>LevGo smartSpatola monouso in polipropilene</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-001-017</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-A3</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi di sicurezza</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-079-718</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina</td><td>Millipore</td><td>567442</td><td>0,90%</td></tr><tr><td>Barche per pesare polistirene Sartorius</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-735-744</td><td></td></tr><tr><td>Scivoli di copertura Superslip - Superslip n. 1.5</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541-055</td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184 Kit di elastomeri siliconici</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9285739</td><td>Polidimetilsilossano (PDMS)</td></tr><tr><td>Ticagrelor</td><td>Cayman Chemicals</td><td>15425</td><td></td></tr><tr><td>Tygon Tubi trasparenti in PVC 1/16" ID, 1/8" OD, lunghezza 50 piedi</td><td>McMaster-Carr</td><td>6516T11</td><td></td></tr><tr><td>Ottone 360 ultralavorabile Bar</td><td>McMaster-Carr</td><td>8954K721</td><td>Per la fabbricazione di stampi master</td></tr><tr><td>Vacutainers</td><td>BD</td><td>363083</td><td></td></tr><tr><td>Punzone per biopsia riutilizzabile con strumento di precisione mondiale, 1,5 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1215626</td><td></td></tr></tbody></table>

microfluidica nella valutazione della funzione piastrinica

Microfluidics in Assessing Platelet Function

Gli esperimenti microfluidici successivi all'uso di questo metodo dovrebbero mostrare la formazione di trombi ricchi di piastrine nella regione di stenosi del canale di flusso (Figura 1). La Figura 1A illustra i risultati rappresentativi in cui le piastrine funzionali hanno formato un trombo nella regione stenotica del canale per bloccare il flusso sanguigno attraverso il canale. Le curve di intensità media di fluorescenza (MFI) delle immagini cinetiche scattate per la durata dell'esperimento illustrano una fase di ritardo, crescita e plateau dell'incorporazione piastrinica nel trombo in crescita (Figura 2A, C). L'aumento delle concentrazioni di un antagonista di P2Y12, Ticagrelor, riduce l'MFI piastrinica e l'area calcolata sotto la curva (AUC) delle curve MFI (Figura 2B, D). Sono necessari tempi di incubazione più lunghi (30 minuti rispetto a 5 minuti) per osservare una pronunciata disfunzione piastrinica, in accordo con una relazione dose-risposta più pronunciata utilizzando l'aggregometria di impedenza del sangue intero dopo un'incubazione di Ticagrelor di 30 minuti rispetto a 5 minuti di incubazione (Figura supplementare S1). In diverse condizioni del veicolo, nel modello microfluidico sono stati osservati effetti simili dipendenti dal tempo dell'inibizione di P2Y12 (Figura supplementare S2).
La visualizzazione di due popolazioni piastriniche nel metodo di rianimazione emostatica simulata illustra l'incorporazione di entrambe le popolazioni piastriniche all'interno del trombo (Figura 3A). L'incorporazione di entrambe le popolazioni piastriniche nel loro corrispondente segnale fluorescente può essere quantificata cineticamente per tutta la durata dell'esperimento tramite misurazioni MFI (Figura 3B). Pendii più ripidi nella fase di crescita e maggiori misurazioni MFI dell'endpoint dimostrano un aumento della funzionalità piastrinica e del potenziale emostatico, che può essere visto nella quantificazione delle piastrine riceventi quando il campione di sangue è stato indotto con disfunzione piastrinica tramite inibizione P2Y12 e, quindi, la rianimazione simulata mescolando sangue intero autologo fresco in un rapporto volumetrico 1:10 colorato con un fluoroforo piastrinico distinto. Con la miscelazione autologa di sangue intero, sono state incorporate più piastrine dal prodotto trasfuso simulato rispetto a un prodotto piastrinico per aferesi al giorno 5 di conservazione a temperatura ambiente, che ha mostrato un'incorporazione minima del prodotto nel trombo in formazione. La miscelazione del prodotto piastrinico a temperatura ambiente del giorno 5 ha anche mostrato una minore incorporazione piastrinica del ricevente rispetto alla miscelazione con sangue intero autologo fresco (Figura 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67214/67214fig01.jpg"> 
Figura 1: Rappresentazione del test di funzionalità piastrinica mediante microfluidica. (A) Viene mostrata la configurazione sperimentale microfluidica schematica per il test di funzionalità piastrinica utilizzando campioni di sangue a basso volume, inclusa una pompa a siringa di estrazione che aspira il sangue attraverso una camera di flusso stenotica, consentendo l'acquisizione di immagini in tempo reale. (B) Viene mostrata una vista laterale di una camera di flusso stenotica, inclusa una superficie rivestita di collagene su cui le piastrine aderiranno, si attiveranno e si aggregheranno, provocando un aumento del trombo nella regione stenotica. (C) Acquisizione di immagini in tempo reale di un campione di sangue citrato sotto flusso in un canale microfluidico stenotico (3.500 s-1) e di un trombo in crescita formato in 300 s. Barre di scala = 200 μm (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67214/67214fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67214/67214fig02.jpg"> 
Figura 2: Riduzione delle variazioni del ripiegamento delle MFI piastriniche e dell'area sotto la curva dopo 30 minuti di incubazione con l'antagonista P2Y12 Ticagrelor. (A) L'incubazione con l'antagonista P2Y12 per soli 5 minuti dimostra fasi di ritardo leggermente estese delle curve MFI e (B) lievi diminuzioni dell'AUC delle MFI. (C) L'incubazione per 30 minuti con l'antagonista P2Y12 determina fasi di ritardo prolungate e valori di MFI dell'endpoint ridotti, nonché (D) una disfunzione più robusta dimostrata tramite AUC MFI. I singoli punti dati rappresentano repliche biologiche e viene mostrata la media ± deviazione standard. Abbreviazioni: MFI = intensità media della fluorescenza; AUC = area sotto la curva; HP-β-CD = 2-idrossipropil-β-ciclodestrina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67214/67214fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67214/67214fig03.jpg"> 
Figura 3: Miscelazione di emoderivati con inibizione coagulopatica P2Y12 nel campione ricevente, simulando la disfunzione piastrinica del paziente, nella camera microfluidica. (A) Unità piastrinica per aferesi (plasma, giorno di conservazione 7) (CD41 in ciano) miscelata in rapporto 1:10 con sangue citrato pre-incubato con 0,8 μM di Ticagrelor per 30 minuti (CD41 in rosso). (B) Curve di intensità di fluorescenza medie normalizzate rappresentative del campione di sangue ricevente che riceve unità piastrinica di aferesi (giorno di conservazione 5) o sangue intero fresco autologo (rapporto 1:10) insieme alla cinetica piastrinica del ricevente nel tempo. Il sangue cittrato del ricevente è stato pre-incubato con 0,8 μM di Ticagrelor per 30 minuti prima di essere miscelato con emoderivati. (C) Immagine z-stack rappresentativa da un dispositivo modificato incollato a un vetrino coprioggetti per microscopia confocale. Il prodotto piastrinico per aferesi è stato miscelato con un campione di sangue trombocitopenico in un rapporto volumetrico 1:5 (prodotto:sangue) oltre a un anticorpo del fattore di von Willebrand (1:600). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67214/67214fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
File supplementare 1: codice Matlab per l'analisi delle immagini. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67214/ImageReader_Jove_Supplemental.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Figura supplementare S1: Aggregometria di impedenza del sangue intero dipendente dal tempo dell'inibizione di P2Y12 con Ticagrelor. L'incubazione per 30 minuti determina una relazione dose-risposta più pronunciata rispetto a 5 minuti. Le soluzioni per veicoli e farmaci sono state utilizzate allo 0,1% v/v. I singoli punti dati rappresentano repliche biologiche e viene mostrata la media ± deviazione standard. Abbreviazioni: AUC = area sotto la curva; HP-β-CD = 2-idrossipropil-β-ciclodestrina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67214/67214_Supp%20Fig%201.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Figura supplementare S2: Inibizione P2Y12 tempo-dipendente con Ticagrelor in un modello microfluidico della funzione piastrinica. Le curve MFI rappresentative e i valori dell'area sotto la curva per le repliche tecniche di un singolo donatore sano sono mostrati con il veicolo di etanolo (1% v/v) utilizzato per la solubilità dei farmaci. Abbreviazioni: MFI = intensità media della fluorescenza; AUC = area sotto la curva. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67214/67214_Supp%20Fig%202.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

Microfluidica nella valutazione della funzione piastrinica

Microfluidics incorporate physiologically relevant substrates and flows that mimic the vasculature and are, therefore, a valuable tool for studying ...

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La cascata l'adesione delle piastrine avviene in presenza di flusso di taglio, non un fattore contabilizzati nel convenzionali (statici) ben piastra saggi. Questo articolo riporta una aggregazione delle piastrine-test utilizzando un microfluidica ben piastra formato di emulare fisiologiche condizioni di flusso di taglio.

L&#39;adesione e aggregazione piastrinica in condizioni di flusso utilizzando celle di flusso Microfluidic

La trasfusione piastrinica e l'emostasi sono state modellate utilizzando la ricostituzione del sangue e camere a flusso microfluidico per studiare la funzione delle piastrine della banca del sangue. I dati dimostrano le conseguenze della lesione da accumulo piastrinico sull'emostasi, in vitro.

Microfluidic Flusso Camere con sangue ricostituito al modello Emostasi e piastrine Transfusion<em&gt; In Vitro</em

Questo articolo descrive un modello sperimentale di emostasi che misura contemporaneamente la funzione piastrinica e la coagulazione. Piastrine e di fibrina fluorescenza viene misurata in tempo reale, e il tasso di piastrine di adesione, il tasso di coagulazione, e l'inizio della coagulazione sono determinati. Il modello viene utilizzato per determinare le proprietà delle piastrine procoagulanti sotto flusso nei concentrati di trasfusione.

Un Microfluidic flusso Camera Modello per la trasfusione di piastrine e Emostasi Misure Deposizione delle piastrine e la formazione di fibrina in tempo reale

Descriviamo un metodo semplice per l'isolamento di piastrine lavate dal sangue umano seguita da agonista indotta misurazioni aggregazione piastrinica turbidimetria. A titolo di esempio applichiamo questo metodo per lo studio della risposta di aggregazione delle piastrine umane al collagene dopo un pre-incubazione con l'inibitore del canale Pannexin1 blu brillante FCF.

Turbidimetria su Human Lavato Piastrine: l&#39;effetto della Pannexin1-inibitore blu brillante FCF sul livello di aggregazione indotta dal collagene

Questo lavoro descrive un metodo basato sulla microscopia a fluorescenza per lo studio dell'adesione piastrinica, della diffusione e della secrezione sotto flusso. Questa piattaforma versatile permette di studiare la funzione piastrinica per la ricerca meccanicistica sulla trombosi e sull'emostasi.

Imaging di cellule vive di degranulazione piastrinica e secrezione sotto flusso

Presentiamo un modello di malattia vascolare in vitro per studiare le interazioni del sangue intero con l'endotelio derivato dal paziente. Questo sistema permette lo studio delle proprietà trombogeniche delle cellule endoteliali primarie in varie circostanze. Il metodo è particolarmente adatto per valutare in situ trombogenicità e terapia anticoagulante durante diverse fasi della coagulazione.

Modello di malattia microfluidico in vitro per studiare le interazioni sangue-endoteliali intere e le dinamiche del coagulo di sangue in tempo reale

Qui viene presentato un protocollo per un nuovo saggio funzionale dinamico multiparametrico delle piastrine utilizzando un biosensore capacitivo. Questo approccio, progettato all'interno di un microambiente semirigido per migliorare la rilevanza fisiologica, fornisce tre parametri di output sensibili alla conta piastrinica, alla forza di stimolazione e alle vie di attivazione.

Valutazione dinamica della funzione piastrinica multiparametrica mediante un biosensore capacitivo

La formazione di piastrine procoagulanti è stata correlata con un aumentato rischio di trombosi. Di seguito viene presentato un preciso protocollo per l'isolamento delle piastrine lavate dal sangue umano, volto a quantificare l'esposizione alla fosfatidilserina e al rilascio di microvescicole, caratteristiche distintive delle piastrine procoagulanti.

Caratterizzazione piastrinica procoagulante mediante misurazione dell'esposizione alla fosfatidilserina e del rilascio di microvescicole da piastrine purificate umane

Questo lavoro descrive un saggio microfluidico che utilizza lo stress di taglio per innescare la formazione di trombo nel sangue e caratterizza il trombo tramite molteplici dimensioni di lettura. Il test può misurare la tendenza protrombotica dei campioni di sangue ed è quindi utile nella diagnosi di malattie, nella scoperta di farmaci e in studi meccanicistici di base relativi alla trombosi.

Saggio di profilazione trombonica: una piattaforma basata sulla microfluidica per caratterizzare in modo completo la trombogenesi biomeccanica

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Valutazione della funzione endoteliale vasodilatatore con l&#39;Endo-PAT 2000

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