Ottimizzazione della preparazione dei campioni per la microscopia elettronica criogenica
11 aprile 2025
Questo protocollo presenta un metodo pratico che utilizza Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) come esempio per affrontare la distribuzione irregolare delle particelle attraverso l'ottimizzazione della preparazione del campione, fornendo un riferimento per i ricercatori per chiarire in modo efficiente le strutture macromolecolari utilizzando la microscopia elettronica criogenica (cryo-EM).
La preparazione dei campioni criogenici deve affrontare sfide che possono limitarne l'efficacia, in particolare la distribuzione irregolare delle particelle. Questo problema spesso porta a una scarsa risoluzione e a una ridotta accuratezza nelle nuove strutture proteiche costruite. Vari approcci sperimentali vengono utilizzati per superare la distribuzione irregolare delle particelle, tra cui l'aggiunta di detergenti o imitatori della membrana al campione, la modifica del film di supporto della griglia e l'inclinazione di uno stadio specifico durante la raccolta dei dati.
Questo protocollo analizza un metodo pratico semplice per affrontare la distribuzione irregolare delle particelle attraverso l'ottimizzazione della preparazione dei campioni, fornendo il nostro riferimento ai ricercatori per illustrare in modo efficiente le strutture delle macromolecole utilizzando il criogeno. Per iniziare, raccogli le frazioni proteiche raggruppate contenenti la proteina MJ small heat shock 16.5. Utilizzare filtri centrifughi con un taglio del peso molecolare di 50 kilodalton per concentrare le frazioni a quattro gradi Celsius a circa 65 milligrammi.
Dopo la concentrazione, centrifugare il campione a 16.000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius per rimuovere gli aggregati. Aliquotare 50 microlitri di volumi di surnatante in provette per PCR a parete sottile da 0,2 millilitri. Per la microscopia elettronica a trasmissione, scongelare due provette proteiche congelate su ghiaccio.
Una volta scongelato, sbattere più volte il tubo per mescolare. Quindi centrifugare la soluzione proteica a 16.000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius per rimuovere gli aggregati. Successivamente, iniettare il surnatante su una colonna per cromatografia ad esclusione dimensionale e raccogliere frazioni di eluizione di 0,5 millilitri.
Raccogli le frazioni eluciane corrispondenti al picco, esibendo la più alta assorbanza ultravioletta a 280 nanometri. Per la sostituzione del tampone, con un paio di forbici, tagliare una membrana di dialisi in pezzi di 30 per 30 millimetri. Incubare i pezzi in acqua distillata o in soluzioni tampone per equilibrarli.
Quindi, aggiungere 55 microlitri di soluzione proteica in una camera con pulsanti di microdialisi da 50 microlitri. Tenere la membrana per dialisi in verticale con una pinza e toccare delicatamente un bordo della membrana contro la carta velina per drenare il liquido in eccesso. Coprire accuratamente il pulsante di microdialisi con la membrana.
Posizionare l'O-ring sopra la membrana per dialisi e arrotolarlo delicatamente nella scanalatura sul bordo del pulsante. Immergere ciascun pulsante di dialisi in un becher separato contenente il tampone di destinazione con il lato della membrana rivolto verso l'alto. Utilizzare una siringa con ago sottile per perforare con cura la membrana e recuperare la soluzione proteica dalla camera di microdialisi.
Caricare cinque microlitri di campione a una concentrazione compresa tra 20 e 120 nanogrammi per millilitro su una griglia di scarica a incandescenza. Preparare tre gocce d'acqua da 50 microlitri ciascuna su un foglio di pellicola di paraffina. Strofinare la superficie della griglia contro le gocce d'acqua per lavare il campione.
Ora carica cinque microlitri di soluzione filtrata di acetato di orinatoio all'1% sulla griglia e pipetta immediatamente la soluzione di acetato di orinatoio. Caricare altri cinque microlitri della soluzione di acetato per orinatoio sulla griglia. Toccare delicatamente il lato della pinzetta della griglia con carta da filtro per rimuovere la soluzione colorante in eccesso e lasciare asciugare la griglia.
Montare le pinzette e il gruppo della griglia di scarica a incandescenza sullo strumento. Quindi caricare quattro microlitri di campione sul lato in carbonio della griglia. Avviare il processo di congelamento a tuffo.
Per preparare le griglie da caricare sul microscopio elettronico a trasmissione, o TEM, posizionare prima una scatola a griglia contenente griglie vetrificate nella stazione di assemblaggio della griglia automatica e svitare il coperchio di una scatola a griglia contenente griglie vetrificate. Posizionare l'anello della griglia automatica nell'apposito spazio di apertura della stazione di assemblaggio. Spostare con cautela la griglia vetrificata dalla scatola della griglia e inserirla all'interno dell'anello della griglia automatica.
Ora allinea il disco per posizionare l'apertura circolare sopra l'anello della griglia automatica e il gruppo griglia. Per fissare la griglia nell'anello della griglia automatica, posizionare lo strumento di inserimento della clip a C sopra la griglia e premere delicatamente verso il basso per fissare la clip a C all'interno. Ruotare il disco all'indietro e spostare le griglie assemblate nella scatola di conservazione della griglia automatica.
Montare la stazione di caricamento della cassetta e raffreddarla con azoto liquido. Posizionare il contenitore a griglia automatica nella stazione di carico. Spostare il gruppo griglia dalla scatola di stoccaggio della griglia automatica alla cassetta.
Utilizzare la maniglia per posizionare la cassetta nella capsula del caricatore automatico. Controllare il perno nel caricatore automatico per confermare il suo libero movimento e assicurarsi che non sia congelato. L'accumulo di particelle negli array è stato osservato su tutte le griglie testate, indipendentemente dalle condizioni tampone o dalle modifiche della carica superficiale.
Una maggiore concentrazione proteica combinata con griglie caricate negativamente in nove millimolari di mobstress, 50 millimolari di cloruro di sodio e 0,1 millimolari di tampone EDTA hanno portato alla distribuzione desiderata di singole particelle all'interno dei fori della griglia, riducendo la formazione di array proteici. Questa condizione ottimizzata ha portato a un elevato valore del rapporto di area FSC conico di 0,80 e a un valore SCF di 0,859, confermando una distribuzione uniforme delle particelle.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo protocollo presenta un metodo pratico per affrontare la distribuzione non uniforme delle particelle nella preparazione del campione per la microscopia elettronica criogenica (cryo-EM) utilizzando Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) come esempio. Fornisce un riferimento per i ricercatori per chiarire efficacemente le strutture macromolecolari.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Microscopia elettronica criogenica
- Ottimizzazione della preparazione del campione
- Analisi delle strutture macromolecolari
Contesto
- La preparazione del campione criogenico affronta sfide come la distribuzione non uniforme delle particelle.
- La scarsa risoluzione e precisione nelle strutture proteiche costruite possono derivare da questo problema.
- Esistono vari approcci sperimentali per mitigare la distribuzione non uniforme delle particelle.
- Detergenti, mimetismi di membrana e modifiche del supporto della griglia sono strategie comunemente utilizzate.
Obiettivo dello studio
- Analizzare un metodo pratico per ottimizzare la preparazione del campione.
- Fornire un riferimento per i ricercatori in cryo-EM.
- Illustrare efficacemente le strutture macromolecolari.
Metodi utilizzati
- Raccogliere frazioni proteiche raggruppate contenenti la piccola proteina del calore shock 16.5 di MJ.
- Utilizzare filtri centrifughi con un taglio del peso molecolare di 50 kilodalton.
- Concentrare le frazioni a quattro gradi Celsius a circa 65 milligrammi.
- Implementare vari approcci sperimentali per migliorare la distribuzione delle particelle.
Principali risultati
- Il protocollo affronta efficacemente la distribuzione non uniforme delle particelle.
- Una migliore preparazione del campione porta a una migliore risoluzione in cryo-EM.
- Fornisce un metodo affidabile per i ricercatori per analizzare le strutture macromolecolari.
- Dimostra l'importanza dell'ottimizzazione del campione nelle tecniche criogeniche.
Conclusioni
- L'ottimizzazione della preparazione del campione è cruciale per un'efficace cryo-EM.
- Il metodo presentato serve come prezioso riferimento per i ricercatori.
- Affrontare la distribuzione non uniforme delle particelle migliora la chiarificazione strutturale.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Optimizing cryo-EM sample preparation directly impacts the reliability of high-resolution macromolecular structure determination, a critical inflection point in early drug discovery and target validation. Addressing uneven particle distribution enhances predictive confidence in structural data, supporting downstream screening and mechanistic de-risking. This workflow refinement is highly relevant for biopharma teams seeking robust, reproducible structural insights to inform portfolio decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables accurate visualization of protein conformations for functional target validation.
- Reduces structural ambiguity, supporting mechanistic de-risking in target selection.
- Improves confidence in structure-based hypothesis testing and pathway analysis.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of homogeneous samples for reproducible cryo-EM assays.
- Supports standardization of grid preparation, enhancing assay scalability and reliability.
- Enables quantitative assessment of particle distribution, critical for screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Provides structural continuity from discovery to preclinical validation when disease-relevant targets are studied.
- Improves risk-adjusted advancement by ensuring structural data quality for candidate selection.
- Supports alignment of structural outputs with translational biomarker strategies when applicable.
Pipeline & Workflow Integration
This sample preparation optimization fits at the interface of early discovery and lead identification, ensuring structural data integrity before downstream screening and preclinical modeling.
- Discovery Biology: Enhances hypothesis testing by minimizing artifacts from uneven particle distribution.
- Screening: Delivers reproducible, high-quality grids for reliable compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative metrics (e.g., FSC area ratio, SCF value) to benchmark sample quality.
- Translational Research: Supports continuity of structural insights into preclinical workflows when relevant.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable protocol for repeated use across targets and programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in structural studies.
- Operational Value: Improves reproducibility and standardization of cryo-EM sample preparation.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions by ensuring high-quality structural data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein purification, grid preparation, and cryo-EM instrumentation.
- Demands access to high-quality centrifugal filters, chromatography, and vitrification equipment.
- Necessitates cross-team standardization of sample handling and grid preparation protocols.
- May require adaptation for different protein classes or buffer conditions.
- Effectiveness depends on careful control of protein concentration and grid surface properties.
