Name: Co-coltura di cellule epiteliali, mesenchimali, endoteliali e immunitarie derivate da iPSC per modellare lintegrità della barriera aerea nella salute e nella malattia polmonare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-06T13:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Scopri come generare un modello multicellulare della barriera aerea utilizzando cellule epiteliali, mesenchimali, endoteliali e macrofagi derivate da iPSC. Questo sistema aiuta a studiare il rimodellamento delle vie aeree e le risposte alle tossine ambientali.

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<meta charset="utf8"></head><body>Modello delle vie aeree per lo studio dell'integrità della barriera polmonare, della malattia e della scoperta di farmaci

<ol><li>Wu, M., Zhang, X., Lin, Y., Zeng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+airway+basal+stem+cells+in+lung+homeostasis+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Res%22%5BJournal%5D)">Roles of airway basal stem cells in lung homeostasis and regenerative medicine.</a> Respir Res. 23 (1), 122(2022).</li>
<li>Blackburn, J. B., Li, N. F., Bartlett, N. W., Richmond, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+update+in+club+cell+biology+and+its+potential+relevance+to+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">An update in club cell biology and its potential relevance to chronic obstructive pulmonary disease.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 324 (5), L652-L665 (2023).</li>
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<li>Khalilgharibi, N., Mao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+form+and+function%3A+On+the+role+of+basement+membrane+mechanics+in+tissue+development%2C+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biol%22%5BJournal%5D)">To form and function: On the role of basement membrane mechanics in tissue development, homeostasis and disease.</a> Open Biol. 11 (2), 200360(2021).</li>
<li>Mcdonald, D. M., Yao, L. C., Baluk, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+airway+blood+vessels+and+lymphatics%3A+Lessons+from+development+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Am+Thorac+Soc%22%5BJournal%5D)">Dynamics of airway blood vessels and lymphatics: Lessons from development and inflammation.</a> Proc Am Thorac Soc. 8 (6), 504-507 (2011).</li>
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<li>Davis, J. D., Wypych, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+functional+heterogeneity+of+the+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cellular and functional heterogeneity of the airway epithelium.</a> Mucosal Immunol. 14 (5), 978-990 (2021).</li>
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<li>Fosse, J. H., Haraldsen, G., Falk, K., Edelmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+in+emerging+viral+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cardiovasc+Med%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells in emerging viral infections.</a> Front Cardiovasc Med. 8, 619690(2021).</li>
<li>Wang, Y., Zheng, J., Wang, X., Yang, P., Zhao, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+and+airway+hyperresponsiveness+associated+with+respiratory+syncytial+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages and airway hyperresponsiveness associated with respiratory syncytial virus infection.</a> Front Immunol. 13, 1012048(2022).</li>
<li>Costa, A., De Souza Carvalho-Wodarz, C., Seabra, V., Sarmento, B., Lehr, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triple+co-culture+of+human+alveolar+epithelium%2C+endothelium+and+macrophages+for+studying+the+interaction+of+nanocarriers+with+the+air-blood+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Triple co-culture of human alveolar epithelium, endothelium and macrophages for studying the interaction of nanocarriers with the air-blood barrier.</a> Acta Biomater. 91, 235-247 (2019).</li>
<li>Leibel, S. L., Mcvicar, R. N., Winquist, A. M., Snyder, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+3D+whole+lung+organoids+from+induced+pluripotent+stem+cells+for+modeling+lung+developmental+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of 3D whole lung organoids from induced pluripotent stem cells for modeling lung developmental biology and disease.</a> J Vis Exp. (170), e62456(2021).</li>
<li>Mccauley, K. B., Hawkins, F., Kotton, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+epithelial-only+airway+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Derivation of epithelial-only airway organoids from human pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 45 (1), e51(2018).</li>
<li>Choi, K. -Y. G., Wu, B. C., Lee, A. H. -Y., Baquir, B., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+organoid+and+air-liquid+interface+models+as+a+screening+method+in+the+development+of+new+host+defense+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Utilizing organoid and air-liquid interface models as a screening method in the development of new host defense peptides.</a> Front Cell Infect Microbiol. 10, 228(2020).</li>
<li>Fulcher, M. L., Randell, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+nasal+and+tracheo-bronchial+respiratory+epithelial+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Human nasal and tracheo-bronchial respiratory epithelial cell culture.</a> Methods Mol Biol. 945, 109-121 (2013).</li>
<li>Hao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+modeling+of+SARS-COV-2+infection+of+in+vitro+cultured+polarized+human+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Long-term modeling of SARS-COV-2 infection of in vitro cultured polarized human airway epithelium.</a> mBio. 11 (6), e02852-e02920 (2020).</li>
<li>Patsch, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+vascular+endothelial+and+smooth+muscle+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Cell Biol. 17 (8), 994-1003 (2015).</li>
<li>Van Wilgenburg, B., Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient%2C+long-term+production+of+monocyte-derived+macrophages+from+human+pluripotent+stem+cells+under+partly-defined+and+fully-defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient, long-term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions.</a> PLoS One. 8 (8), e71098(2013).</li>
<li>Pouyanfard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+macrophages+ameliorate+liver+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human-induced pluripotent stem cell-derived macrophages ameliorate liver fibrosis.</a> Stem Cells. 39 (12), 1701-1717 (2021).</li>
<li>Ardini-Poleske, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lungmap%3A+The+molecular+atlas+of+lung+development+program%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Lungmap: The molecular atlas of lung development program.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 313 (5), L733-L740 (2017).</li>
<li>Ronaghan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M1-like%2C+but+not+m0-+or+m2-like%2C+macrophages%2C+reduce+RSV+infection+of+primary+bronchial+epithelial+cells+in+a+media-dependent+fashion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">M1-like, but not m0- or m2-like, macrophages, reduce RSV infection of primary bronchial epithelial cells in a media-dependent fashion.</a> PLoS One. 17 (10), e0276013(2022).</li>
<li>Gotoh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+alveolar+epithelial+spheroids+via+isolated+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Generation of alveolar epithelial spheroids via isolated progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Rep. 3 (3), 394-403 (2014).</li>
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<li>Firth, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+multiciliated+cells+in+functional+airway+epithelia+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Generation of multiciliated cells in functional airway epithelia from human induced pluripotent stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (17), E1723-E1730 (2014).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>piastre a 12 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>inserti a 12 pozzetti, 0,4 &; micro; m, traslucido&nbsp;</td><td>VWR</td><td>10769-208</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanolo&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Tech</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>Activina A R</td><td>& D Systems</td><td>338-AC</td><td></td></tr><tr><td>Acido retinoico all-trans (RA)&nbsp;</td>Acido ascorbico <td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>B27 senza acido retinoico&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>BMP4&nbsp;</td><td>R& D Systems</td><td>314-BP/CF</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA) Frazione V, soluzione al 7,5%&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>Br-cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5386</td><td></td></tr><tr><td>CD 14 (FITC)</td><td>BioLegend</td><td>982502</td><td></td></tr><tr><td>CD 31 PECAM-1(APC)</td><td>R& Sistema D</td><td>FAB3567A</td><td></td></tr><tr><td>CD 45 (PE)</td><td>BD Biosciences</td><td>560975</td><td></td></tr><tr><td>CD 68 (PE)</td><td>BioLegend</td><td>33808</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab120890</td><td></td></tr><tr><td>CPM</td><td>Fujifilm</td><td>014-27501</td><td></td></tr><tr><td>Desametasone&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>Dispase&nbsp;</td><td>StemCellTech</td><td>7913</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10565042</td><td></td></tr><tr><td>Dorsomorfina</td><td>R& D Systems</td><td>3093</td><td></td></tr><tr><td>E-CAD/CD 324 (APC)</td><td>BioLegend</td><td>324107</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>R& D Systems</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>EGM2 Medium</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>EPCAM/CD 326 (APC)</td><td>BioLegend</td><td>324212</td><td></td></tr><tr><td>FBS&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10082139</td><td></td></tr><tr><td>FGF10</td><td>R& D Systems</td><td>345-FG/CF</td><td></td></tr><tr><td>FGF7</td><td>R& D Systems</td><td>251-KG/CF</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Fisher</td><td>356008</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Abcam</td><td>ab120058</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax&nbsp;</td><td>Tecnologie per la vita</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Ham' s F12&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>IBMX (3-isobtil-1-metilxantina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>IL-3</td><td>Peprotech</td><td>200-03</td><td></td></tr><tr><td>Iscove' s Dulbecco' modificato s Medium (IMDM) + Glutamax&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>31980030</td><td></td></tr><tr><td>Sostituzione del siero knockout (KSR)</td><td>Life Technologies</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>300-25</td><td></td></tr><tr><td>Monotioglicerolo</td><td>Kit Sigma</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR plus (10/custodia)</td><td>Stem Cell Tech</td><td>5825</td><td></td></tr><tr><td>N2&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco 10010023</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pen/streptococco</td><td>Lonza</td><td>17-602F</td><td></td></tr><tr><td>ReleSR</td><td>Stem Cell Tech</td><td>5872</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 + Glutamax&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>12633012</td><td></td></tr><tr><td>SB431542&nbsp;</td><td>R& D Systems</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>PeproTech</td><td>300-07</td><td></td></tr><tr><td>SMA</td><td>Invitrogen</td><td>50-9760-80</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff APEL 2 Medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5275</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td></td></tr><tr><td>VEGF165</td><td>Preprotech</td><td>100-20</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin</td><td>Cell Signaling</td><td>5741S</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (Inibitore della roccia)&nbsp;</td><td>R& D Systems</td><td>1254/1</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1</td><td>Invitrogen</td><td>339100</td><td></td></tr></tbody></table>

co-coltura di cellule epiteliali, mesenchimali, endoteliali e immunitarie derivate da ipsc per modellare l'integrità della barriera aerea nella salute e nella malattia polmonare

iPSC-Derived Epithelial, Mesenchymal, Endothelial, and Immune Cell Co-Culture to Model Airway Barrier Integrity in Lung Health and Disease

Esistono diverse fasi in cui la differenziazione degli organoidi delle vie aeree, delle cellule endoteliali, delle cellule immunitarie e delle co-colture derivate da iPSC può essere valutata come completata con successo. Le differenziazioni possono essere eseguite in diverse linee iPSC e questo protocollo è stato testato in almeno cinque linee diverse. Il protocollo deve essere adattato a ogni nuova linea iPSC, in particolare modificando e ottimizzando la densità di semina.
La resa di successo degli organoidi delle vie aeree derivati da iPSC può essere valutata in campo chiaro e avrà quattro caratteristiche: confini/bordi definiti, morfologia traslucida/cistica, capacità di proliferare/espandersi e mancanza di cellule necrotiche. Gli organoidi delle vie aeree che appaiono sfocati non aumentano di dimensioni durante le 2 settimane di coltura e presentano necrosi non devono essere utilizzati per esperimenti di co-coltura. Organoidi con uno spesso strato luminale alla periferia vs. Gli organoidi traslucidi/cistici possono ancora essere utilizzati per esperimenti successivi. Tuttavia, gli organoidi traslucidi/cistici delle vie aeree sono composti prevalentemente da cellule basali, mentre gli organoidi spessi a doppia membrana sono composti prevalentemente da cellule club. Poiché le cellule basali proliferano e si espandono facilmente, sono più adatte per la coltura e la polarizzazione dell'interfase aria-liquido. Altri metodi per valutare la resa di successo degli organoidi polmonari derivati da iPSC sono l'analisi di citometria a flusso allo stadio di progenitore polmonare (giorno 16 della differenziazione) per il marcatore di superficie CPM (Tabella 1), una resa di differenziazione riuscita &gt;50% di cellule CPM+.
Per la dissociazione degli organoidi delle vie aeree e la coltura dell'interfase aria-liquido, assicurarsi che tutto il polimero ECM sia stato rimosso, altrimenti impedirà alle cellule di espandersi sulla membrana. Le cellule devono essere confluenti entro il giorno 3 di coltura, prima del sollevamento aereo. La conferma dei tipi di cellule nelle iAirways può essere valutata mediante colorazione per i rispettivi marcatori specifici del tipo di cellula: cellule basali (p63+), cellule club (SCGB1A1+), cellule caliciformi (MUC5AC+) e cellule ciliate (AcTub+). La caratterizzazione e i marcatori specifici del tipo di cellula polmonare sono verificati su LungMAP21. Il mesenchima può essere rilevato con anticorpi contro la vimentina o l'actina della muscolatura liscia. Per generare più cellule ciliate, le colture possono richiedere il sollevamento dell'aria per un periodo di tempo più lungo o l'aggiunta di DAPT.
La resa di successo delle cellule endoteliali derivate da iPSC può essere valutata in campo chiaro, mostrando una morfologia simile a un ciottolo (giorno 6 della differenziazione endoteliale derivata da iPSC). Una coltura endoteliale derivata con iPSC di successo conterrà il &gt;50% di cellule CD31+ e dovrebbe essere generato un numero sufficiente di cellule in modo che, dopo lo smistamento, la resa dovrebbe essere superiore a 500.000 cellule. Le cellule possono essere fatte passare o crioconservate e il marcatore CD31 deve essere testato tramite flusso ad ogni passaggio o nuova coltura. Le cellule non devono essere fatte passare oltre P4. Per riferimento, vedere Ordinamento delle cellule endoteliali derivate da iPSC pre/post CD31 (Figura 1C). Le cellule endoteliali saranno piatte con un grande corpo cellulare con morfologia allungata e a forma di fuso.
Per la differenziazione dei macrofagi, i corpi embrioidi dovrebbero rimanere sul fondo del pozzetto ULA e solo un EB dovrebbe essere in ogni pozzetto. Dovrebbero mostrare cambiamenti cistici entro il 5-7° giorno. Se non formano un EB dopo la centrifugazione, seminare le iPSC nella piastra ULA a 96 pozzetti senza centrifugare. Potrebbe essere necessario aumentare il numero di iPSC. Il successo della produzione di cellule immunitarie derivate da iPSC dipende interamente dalla capacità dei corpi embrioidi (EB) di svilupparsi in cisti (7° giorno di differenziazione). Gli EB immunitari derivati da iPSC che non sviluppano cisti non formeranno stroma quando vengono placcati sulla gelatina e non produrranno progenitori mieloidi. Dopo il trasferimento nella piastra rivestita di gelatina, gli EB devono rimanere attaccati al fondo della piastra. Il movimento della piastra deve essere eseguito con attenzione per non rimuoverli. Le piastre devono essere cambiate manualmente due volte alla settimana e le celle sospese devono essere inserite nel Mac-CM2 o crioconservate. Inoltre, dopo aver raccolto i progenitori mieloidi sospesi, dovrebbero aderire al pallone di plastica non rivestito e generare cellule luminose in campo chiaro con vacuoli, indicando i macrofagi. Il marcatore per i monociti, CD14+, dovrebbe essere del &gt;90% nelle cellule sospese. Il marcatore dei macrofagi, CD68, dovrebbe aumentare nel tempo, con ~50% dei macrofagi che esprimono CD68+ dopo 2 settimane (Figura 1D). L'efficienza di adesione deve essere determinata per ciascuna linea cellulare. Raggiungiamo un'efficienza di adesione media del 20%. Per la polarizzazione, i macrofagi M0 vengono polarizzati con macrofagi M1 (iPSC-M1) o M2 (iPSC-M2) per 48 ore nel mezzo di differenziazione II integrato con diversi stimoli: 100 ng/mL LPS e 20 ng/mL IFN-g per la polarizzazione M1 o 50 ng/mL IL-4 e 20 ng/mL IL-13 per la polarizzazione M2. Il marcatore per la polarizzazione M1 è CD80+ e la polarizzazione M2 è CD206+.
Il successo della generazione della tripla co-coltura può essere valutato tramite immunofluorescenza per i marcatori epiteliali a giunzione stretta EPCAM, ECAD o ZO-1 o per il marcatore endoteliale a giunzione stretta CD31 (Figura 2C, Tabella 1). La funzionalità della tripla co-coltura può essere valutata anche attraverso la resistenza epiteliale/endoteliale transelettrica (TEER). Le co-colture di organoidi ed endoteliali delle vie aeree ben assemblate avranno una maggiore resistenza elettrica, indicando una comunicazione e una connessione cellulare ottimali. Gli insulti ambientali, come le sigarette elettroniche o la sfida virale, comprometteranno l'integrità della barriera epiteliale ed endoteliale, con conseguente riduzione della resistenza elettrica della co-coltura (Figura 3A, B) e giunzioni strette disorganizzate (Figura 3C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67247/67247fig01v2.jpg"> 
Figura 1: Differenziazione e caratterizzazione di colture di epitelio delle vie aeree, endotelio e colture immunitarie derivate da iPSC. (A) Schema delle differenziazioni dirette da iPSC per l'assemblaggio delle iAirway. (B) organoidi dell'epitelio delle vie aeree derivati da iPSC caratterizzati mediante analisi in campo chiaro (a sinistra) e citometria a flusso (a destra) per EPCAM ed ECAD. (C) endotelio delle vie aeree derivato da iPSC caratterizzato da campo chiaro (a sinistra), immunofluorescenza e analisi di citometria a flusso (a destra) per CD31. Il rispettivo campo chiaro dopo l'ordinamento del CD31 è mostrato a destra. (D) I macrofagi derivati da iPSC sono caratterizzati mediante analisi in campo chiaro (a sinistra) e citometria a flusso (a destra) per il marcatore panematopoietico CD45, il produttore di monociti CD14 e il marcatore macrofagico CD68. Barre di scala: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67247/67247fig01largev2.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67247/67247fig02.jpg"> 
Figura 2: Co-coltura di cellule epiteliali, mesenchimali, endoteliali e macrofagiche derivate da iPSC. (A) Schema dell'assemblaggio delle vie aeree. (B) Immagini in campo chiaro della rispettiva monocoltura epiteliale ed endoteliale, della bicoltura epiteliale ed endoteliale e della co-coltura epiteliale, endoteliale e macrofagica. Macrofagi marcati con citotracker rosso. Barre della scala: 100 μm. (C) Colorazione immunofluorescente per il marcatore a giunzione stretta ZO-1 sul lato apicale dell'inserto di coltura cellulare e CD31 sul lato basolaterale. Barre di scala: 100 μm. (D) Sezione trasversale dell'inserto di coltura cellulare con organoidi dissociati delle vie aeree sul lato apicale, 1 settimana dopo il sollevamento aereo. Il pannello di sinistra con colorazione H&amp;E con la freccia nera mostra le cellule ciliate. Il pannello centrale, con imaging in immunofluorescenza, mostra il marcatore epiteliale E-caderina (ECAD). Il pannello di destra, con imaging in immunofluorescenza, mostra marcatori mesenchimali come la vimentina (VIM) e l'actina della muscolatura liscia (SMA). Barre di scala: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67247/67247fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67247/67247fig03.jpg"> 
Figura 3: Cambiamenti nella funzione di barriera delle vie aeree delle iAirways esposte a sigarette elettroniche e virus. (A) Schema dello strumento di misurazione della resistenza epiteliale/endoteliale transelettrica (TEER). (B) Grafico a barre del TEER dopo 7 giorni dall'aggiunta di sigaretta elettronica al mentolo ai supporti. Intervallo di confidenza medio +/- 95%. N = 5 repliche biologiche e 3 repliche tecniche; valore p &lt;0,001. (C) Colorazione immunofluorescente per la proteina a giunzione stretta ZO-1 prima e dopo l'infezione da SARS-CoV-2. Si noti il layout disordinato di ZO-1 post-infezione. Barre della scala: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67247/67247fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anticorpo</td>
			<td>Applicazione</td>
			<td>Diluizione</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD 31 PECAM-1(APC)</td>
			<td>citometria a flusso (FC)</td>
			<td>10 μl in tampone 100 ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPCAM/CD 326 (APC)</td>
			<td>FC</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-CAD/CD 324 (APC)</td>
			<td>FC</td>
			<td>5 μl in tampone 100 ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPM</td>
			<td>FC</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD 45 (PE)</td>
			<td>FC</td>
			<td>5 μl in tampone 100 ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD 14 (FITC)</td>
			<td>FC</td>
			<td>5 μl in tampone 100 ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD 68 (PE)</td>
			<td>FC</td>
			<td>5 μl in tampone 100 ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZO-1</td>
			<td>Immunofluorescenza (IF)</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin</td>
			<td>SE</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMA</td>
			<td>SE</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1: Anticorpi utilizzati in FACS e immunofluorescenza.
File supplementare 1: Composizioni multimediali e buffer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67247/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

Co-coltura di cellule epiteliali, mesenchimali, endoteliali e immunitarie derivate da iPSC per modellare l'integrità della barriera aerea nella salute e nella malattia polmonare

Human lung tissue is composed of an interconnected network of epithelium, mesenchyme, endothelium, and immune cells from the upper airway of the ...

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Co-coltura di cellule epiteliali, mesenchimali, endoteliali e immunitarie derivate da iPSC per modellare lintegrità della barriera aerea nella salute e nella malattia polmonare (Video) | JoVE Journal

Co-coltura di cellule epiteliali, mesenchimali, endoteliali e immunitarie derivate da iPSC per modellare l'integrità della barriera aerea nella salute e nella malattia polmonare

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