Istituzione di modelli ortotopici di xenotrapianto derivati da pazienti per tumori cerebrali utilizzando un dispositivo stereotassico

Nella mia ricerca, ci concentriamo sullo sviluppo di nuovi trattamenti per i tumori cerebrali infantili aggressivi come i gliomi diffusi della linea mediana, i gliomi di alto grado, gli ependimomi e gli ameloblastomi. Il nostro obiettivo è quello di trovare nuovi bersagli farmacologici e sviluppare terapie che possano fare la differenza nei pazienti, studiando anche come questi tumori possono influenzare l'ambiente cerebrale circostante. Nella ricerca sui tumori cerebrali pediatrici, abbiamo sviluppato modelli di xenotrapianto derivati da pazienti utilizzando iniezioni intracraniche, imaging avanzato e screening farmacologico ad alto rendimento.

Tecniche come la trascrittomica a cellula singola e speciale ci aiutano a capire come il tumore influisce sull'ambiente cerebrale e sugli effetti del trattamento, permettendoci di esplorare nuove terapie. Il nostro gruppo di tumori cerebrali presso il Children's Cancer Institute ha sviluppato molti modelli di pediatria dei tumori cerebrali pediatrici attraverso il programma di medicina personalizzata Zero Childhood Cancer. Abbiamo scoperto che i gliomi diffusi della linea mediana sono resistenti ai trattamenti farmacologici a causa di una barriera emato-encefalica intatta.

Terapie promettenti mirate alle vie epigenetiche e oncogeniche hanno migliorato la sopravvivenza pediatrica e sono ora in fase di sviluppo clinico. Utilizzando modelli ortotopici di tumore cerebrale, vorremmo capire come i tumori influenzano la vascolarizzazione cerebrale. Applicando tecniche come la trascrittomica speciale, vorremmo identificare i percorsi influenzati dai tumori cerebrali.

Questa conoscenza ci aiuterà a identificare i modulatori della barriera emato-encefalica che possono allentare la barriera, consentendo ai trattamenti farmacologici di penetrare in modo più efficace. Per iniziare, scongelare le cellule tumorali cerebrali che formano la neurosfera. In una cappa di biosicurezza, pipettare con cura le cellule coltivate e il terreno di coltura dal pallone di coltura tissutale in una provetta conica da 50 millilitri con una pipetta sierologica.

Centrifugare la provetta conica a 300 G per un massimo di cinque minuti a temperatura ambiente. Con una pipetta da 25 millilitri, aspirare il terreno sopra il pellet, lasciando circa 0,5 millilitri nella provetta. Pipettare delicatamente le cellule su e giù 10 volte con una pipetta da un millilitro per dissociare il pellet cellulare.

Aggiungere il tripano blu alla sospensione cellulare e contare con un emocitometro. Aliquotare la sospensione cellulare contenente due milioni di cellule in una provetta nuova. Aggiungere 0,5 millilitri di PBS alla sospensione cellulare.

Quindi centrifugare a 300 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il surnatante e lavare di nuovo. Dopo il lavaggio finale, aspirare quanto più PBS possibile.

Quindi posizionare il pellet cellulare e 50 microlitri di idrogel di matrice extracellulare sul ghiaccio. Mescolare prontamente il pellet cellulare con l'idrogel della matrice extracellulare per prepararsi all'iniezione intracranica. Per iniziare, montare un mouse anestetizzato su un dispositivo stereotassico.

Assicurarsi che i denti anteriori siano fissati nella barra incisiva e che il cono del naso fissi l'animale in posizione. Disinfettare la testa del topo con una punta di cotone imbevuta di iodio, seguita da una salvietta di isopropanolo. Quindi applicare un unguento per gli occhi corneali su entrambi gli occhi per prevenire la secchezza.

Fai un'incisione alla base del cervelletto ed estendila attraverso il cranio fino al punto medio per creare un taglio lungo un centimetro lungo la faccia superiore del cranio. Stringere la pelle tra le orecchie per esporre il cranio, quindi stringere le barre delle orecchie per fissare la testa. Pulisci la superficie del cranio e asciugala accuratamente con un batuffolo di cotone.

Fissare il trapano sul telaio stereotassico e individuare la struttura bregma o lambdoide utilizzando il trapano. Una volta stabilite le coordinate, praticare con cura un piccolo foro di bava nell'osso nel sito designato. Risospendere più volte la sospensione di cellule per l'iniezione del tumore cerebrale preparata utilizzando una pipetta, assicurandosi che si evitino bolle d'aria.

Aspirare due microlitri della miscela cellulare in una microsiringa di vetro freddo prelavata e collegare la siringa al telaio stereotassico. Regolare l'ago sulla punta del cranio per prepararsi all'iniezione. Entro 30 secondi, iniettare le cellule nella regione perforata.

Pulire la sospensione cellulare rifluita con un panno a base di isopropanolo durante l'iniezione. Lasciare la siringa in posizione per un minuto per evitare il riflusso e consentire all'idrogel della matrice extracellulare di depositarsi. Quindi rimuovere la siringa e pulire la ferita con una salvietta di isopropanolo.

Se necessario, sigillare l'incisione con colla per la pelle o clip per ferite. Posizionare il mouse in posizione sdraiata in una gabbia di recupero pulita con una lampada termica o un termoforo per mantenere il calore. Monitorare continuamente l'animale fino a quando non inizia a muoversi in modo indipendente e normale.

Dopo l'iniezione intracranica, monitorare i topi cinque giorni alla settimana per valutare il loro benessere generale. Registra parametri come la perdita di peso, il livello di attività, la postura, i segni di disidratazione e le condizioni del pelo su un foglio di monitoraggio designato. Gli animali hanno mostrato sintomi distinti in base al tipo di tumore e al sito di iniezione, come l'inclinazione della testa nei tumori del tronco encefalico e l'ingrossamento del proencefalo per gliomi corticali o ependimomi.

Le iniezioni intracraniche di cellule di medulloblastoma D425 a diverse densità hanno rivelato una correlazione diretta tra densità cellulare e velocità di attecchimento del tumore con 100.000 cellule che portano alla sopravvivenza mediana più breve di 15 giorni. Le cellule di glioma di alto grado iniettate nella corteccia hanno portato a una sopravvivenza mediana di circa 25,5 giorni con analisi immunoistochimiche che hanno rivelato una grande massa tumorale altamente nucleata e un aumento della vascolarizzazione, nonché abbondanti cellule proliferative Ki-67 positive. Le iniezioni del tronco encefalico di cellule di glioma di alto grado hanno determinato una sopravvivenza mediana di circa 26 giorni con analisi immunoistochimiche che indicavano una massa tumorale nel ponte superiore e un'infiltrazione leptomeningea, nonché cellule proliferative Ki-67 positive nelle aree infiltrate.