Name: Analisi al microscopio confocale dello smistamento delle proteine in Plasmodesmata in Nicotiana benthamiana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-01T14:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 54 s
Description: Scopri l'analisi al microscopio confocale dello smistamento delle proteine nei plasmodesmi di Nicotiana benthamiana durante le interazioni virali. Questo metodo rivela la dinamica di localizzazione di PDLP5 e TVCV MP.

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<meta charset="utf8"></head><body>Esplorazione della funzione dei plasmodesmi: microscopia confocale di proteine mirate

<ol><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plasmodesmata-localized+protein+mediates+crosstalk+between+cell-to-cell+communication+and+innate+immunity+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A plasmodesmata-localized protein mediates crosstalk between cell-to-cell communication and innate immunity in Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 23 (9), 3353-3373 (2011).</li>
<li>Benitez-Alfonso, Y., Faulkner, C., Ritzenthaler, C., Maule, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata+gateways+to+local+and+systemic+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant-Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata gateways to local and systemic virus infection.</a> Mol Plant-Microbe Interact. 23 (11), 1403-1412 (2010).</li>
<li>Bayer, E. M., Benitez-Alfonso, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata%3A+Channels+under+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata: Channels under pressure.</a> Annu Rev Plant Biol. 75, 21(2024).</li>
<li>Maule, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata%3A+Structure%2C+function+and+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata: Structure, function and biogenesis.</a> Curr Opin Plant Biol. 11, 680-686 (2008).</li>
<li>Fernandez-Calvino, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+plasmodesmal+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis plasmodesmal proteome.</a> PLoS One. 6 (4), e18880(2011).</li>
<li>Kirk, P., Amsbury, S., German, L., Gaudioso-Pedraza, R., Benitez-Alfonso, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+meta-proteomic+pipeline+for+the+identification+of+plasmodesmata+proteins+and+regulatory+conditions+in+diverse+plant+species%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">A comparative meta-proteomic pipeline for the identification of plasmodesmata proteins and regulatory conditions in diverse plant species.</a> BMC Biol. 20, 128(2022).</li>
<li>Levy, A., Erlanger, M., Rosenthal, M., Epel, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plasmodesmata-associated+%CE%B2-1%2C3-glucanase+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+J%22%5BJournal%5D)">A plasmodesmata-associated β-1,3-glucanase in Arabidopsis.</a> The Plant J. 49 (4), 669-682 (2007).</li>
<li>Kankanala, P., Czymmek, K., Valent, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+for+rice+membrane+dynamics+and+plasmodesmata+during+biotrophic+invasion+by+the+blast+fungus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Roles for rice membrane dynamics and plasmodesmata during biotrophic invasion by the blast fungus.</a> The Plant Cell. 19 (2), 706-724 (2007).</li>
<li>Aung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+bacteria+target+plant+plasmodesmata+to+colonize+and+invade+surrounding+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Pathogenic bacteria target plant plasmodesmata to colonize and invade surrounding tissues.</a> The Plant Cell. 32 (3), 595-611 (2020).</li>
<li>Cui, W., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+callose+synthases+CalS1%2F8+regulate+plasmodesmal+permeability+during+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Plants%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis callose synthases CalS1/8 regulate plasmodesmal permeability during stress.</a> Nat Plants. 2 (5), 160(2016).</li>
<li>Liu, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phytosphinganine+affects+plasmodesmata+permeability+via+facilitating+PDLP5-stimulated+callose+accumulation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant%22%5BJournal%5D)">Phytosphinganine affects plasmodesmata permeability via facilitating PDLP5-stimulated callose accumulation in Arabidopsis.</a> Mol Plant. 13 (1), 128-143 (2020).</li>
<li>Caillaud, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plasmodesmal+protein+PDLP1+localizes+to+haustoria-associated+membranes+during+downy+mildew+infection+and+regulates+callose+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">The plasmodesmal protein PDLP1 localizes to haustoria-associated membranes during downy mildew infection and regulates callose deposition.</a> PLoS Pathog. 10 (11), e1004496(2014).</li>
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<li>Thomas, C. L., Bayer, E. M., Ritzenthaler, C., Fernandez-Calvino, L., Maule, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+targeting+of+a+plasmodesmal+protein+affecting+cell-to-cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Specific targeting of a plasmodesmal protein affecting cell-to-cell communication.</a> PLoS Biol. 6 (1), e7(2008).</li>
<li>Lim, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata+localizing+proteins+regulate+transport+and+signaling+during+systemic+acquired+immunity+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata localizing proteins regulate transport and signaling during systemic acquired immunity in plants.</a> Cell Host Microbe. 19 (4), 541-549 (2016).</li>
<li>Sheludko, Y. V., Sindarovska, Y. R., Gerasymenko, I. M., Bannikova, M. A., Kuchuk, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+several+Nicotiana+species+as+hosts+for+high-scale+Agrobacterium-mediated+transient+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Comparison of several Nicotiana species as hosts for high-scale Agrobacterium-mediated transient expression.</a> Biotechnol Bioeng. 96 (3), 608-614 (2007).</li>
<li>Walhout, A. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATEWAY+recombinational+cloning%3A+Application+to+the+cloning+of+large+numbers+of+open+reading+frames+or+ORFeomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">GATEWAY recombinational cloning: Application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes.</a> Methods Enzymol. 328, 575-592 (2000).</li>
<li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dsRNA-induced+immunity+targets+plasmodesmata+and+is+suppressed+by+viral+movement+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">dsRNA-induced immunity targets plasmodesmata and is suppressed by viral movement proteins.</a> The Plant Cell. 35 (10), 3845-3869 (2023).</li>
<li>Roberts, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+the+frequency+and+architecture+of+plasmodesmata+during+the+sink-source+transition+in+tobacco+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in the frequency and architecture of plasmodesmata during the sink-source transition in tobacco leaves.</a> Protoplasma. 218, 31-44 (2001).</li>
<li>Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plasmodesmal+localization+signal+of+TMV+MP+is+recognized+by+plant+synaptotagmin+SYTA%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">The plasmodesmal localization signal of TMV MP is recognized by plant synaptotagmin SYTA.</a> mBio. 9 (4), e01314-e01318 (2018).</li>
<li>Ward, S. J., Ramirez, M. D., Neelakantan, H., Walker, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabidiol+prevents+the+development+of+cold+and+mechanical+allodynia+in+paclitaxel-treated+female+C57Bl6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Anesth+Analg%22%5BJournal%5D)">Cannabidiol prevents the development of cold and mechanical allodynia in paclitaxel-treated female C57Bl6 mice.</a> Anesth Analg. 113 (4), 947-950 (2011).</li>
<li>Erkkilä, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widefield+fluorescence+lifetime+imaging+of+protoporphyrin+IX+for+fluorescence-guided+neurosurgery%3A+An+ex+vivo+feasibility+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Widefield fluorescence lifetime imaging of protoporphyrin IX for fluorescence-guided neurosurgery: An ex vivo feasibility study.</a> J Biophotonics. 12 (6), e201800378(2019).</li>
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<li>Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+functional+plasmodesmal+localization+signal+in+a+plant+viral+cell-to-cell-movement+protein%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Identification of a functional plasmodesmal localization signal in a plant viral cell-to-cell-movement protein.</a> mBio. 7 (1), e2052-e2015 (2016).</li>
<li>Kumar, G., Dasgupta, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability%2C+functions+and+interactions+of+plant+virus+movement+proteins%3A+what+do+we+know+so+far%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Variability, functions and interactions of plant virus movement proteins: what do we know so far.</a> Microorganisms. 9 (4), 695(2021).</li>
<li>Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ins+and+outs+of+nondestructive+cell-to-cell+and+systemic+movement+of+plant+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">The ins and outs of nondestructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses.</a> Crit Rev Plant Sci. 23 (3), 195-250 (2004).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Motore ABT AC 1 fase</td><td>BRANDTECH</td><td>&nbsp; ABF63/4C-7RQ</td><td></td></tr><tr><td>Agrobacterium tumefaciens EHA105</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Controllo della contaminazione&nbsp;</td><td>CCI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gateway BP Clonasi II Miscela enzimatica</td><td>Invitrogen</td><td>#11789020</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR Clonasi II Miscela enzimatica</td><td>Invitrogen</td><td>#11791020</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 8.0.1.</td><td>Software GraphPad Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immagine J</td><td>National Institutes of Health e il Laboratorio per la strumentazione ottica e computazionale Microscopio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>confocale a scansione laser</td><td>Zeiss</td><td>LSM 900</td><td></td></tr><tr><td>Nicotiana benthamiana</td><td>Specie</td><td></td><td></td>vegetali</tr><tr><td>pDONR207</td><td>Invitrogen</td><td>#12213013</td><td></td></tr><tr><td>Q5 DNA polimerasi ad alta fedeltà</td><td>NUOVO OBS</td><td>#M0491S</td><td></td></tr></tbody></table>

analisi al microscopio confocale dello smistamento delle proteine in plasmodesmata in nicotiana benthamiana

Confocal Microscopy Analysis of Protein Sorting to Plasmodesmata in Nicotiana benthamiana

Per facilitare gli studi sulla funzione della malattia di Parkinson nella fisiologia delle piante e nelle interazioni con i patogeni, sono state sviluppate tre proteine di riferimento semplici e affidabili per la localizzazione della malattia di Parkinson. Sono state selezionate due proteine PD cellulari e una proteina MP derivata da patogeni codificata dal tobamovirus vegetale TVCV. La localizzazione subcellulare di queste proteine è stata visualizzata utilizzando un reporter autofluorescente EGFP fuso al C-terminale di ciascuna proteina. In un approccio alternativo, le PD sono state visualizzate utilizzando la colorazione blu all'anilina dei depositi di callosio associati alla PD. Gli esperimenti hanno mostrato che sia PDLP5 che MP mostravano una localizzazione puntiforme di PD, con MP localizzato anche nel nucleo cellulare (Figura 1A), come precedentemente notato25. Al contrario, PDCB1 sembrava partizionare tra PD ed ER (Figura 1A). Per i ricercatori meno esperti nell'interpretazione della localizzazione subcellulare delle proteine marcate con GFP, la Figura 1A illustra anche il caratteristico pattern nucleocitoplasmatico di EGFP espresso nelle cellule vegetali. Per confermare il segnale ER di PDCB1, abbiamo co-espresso PDCB1 con un marcatore ER e abbiamo scoperto che il segnale PDCB1 si sovrapponeva al segnale del marcatore ER (Figura 1B). Per valutare l'efficienza della localizzazione PD delle proteine testate, è stata calcolata la percentuale di cellule che esprimono il segnale fluorescente che mostravano una localizzazione PD di questo segnale (Tabella 1).
Per l'identificazione della localizzazione subcellulare mediante l'impiego di proteine di riferimento, è utile comprendere la scala temporale dell'espressione della proteina di riferimento e i potenziali cambiamenti della sua localizzazione. La Figura 2 mostra tale cinetica per MP, PDLP5 e PDCB1 quando le PD stesse sono state visualizzate mediante colorazione blu all'anilina. Sia MP che PDLP5 hanno iniziato ad accumularsi a PD già a un giorno dopo l'infiltrazione (dpi), e questo accumulo ha raggiunto un massimo apparente a 2 dpi, rimanendo stabile per altri 5 giorni, dopodiché l'intensità del segnale è diminuita, molto probabilmente a causa della degradazione della proteina. L'andamento temporale della selezione subcellulare di PDCB1 è stato più complesso: per i primi 3 dpi, PDCB1 ha mostrato un segnale ER comparabilmente forte, che ha quasi completamente oscurato la localizzazione del segnale PD-specifico, mentre a 5 dpi, quest'ultimo segnale è diventato più pronunciato (Figura 2), anche se in un minor numero di cellule. È interessante notare che l'emergere del chiaro pattern di localizzazione PD di PDCB1 dopo 5 dpi ha coinciso con un numero sostanzialmente inferiore di cellule che mostravano il segnale EGFP (Figura 1 supplementare). Pertanto, PDLP5 e MP possono funzionare come proteine di riferimento per la PD con scarso background nella maggior parte degli altri compartimenti cellulari, con una finestra temporale di visualizzazione ottimale di 2-5 dpi. PDCB1, d'altra parte, non è adatto come marcatore PD.
È stato quindi verificato che i marcatori PD mantengono la loro specificità di localizzazione subcellulare in presenza di altre proteine PD. A tal fine, MP-EGFP o PDLP5-EGFP è stato co-espresso con un26 MP di un altro virus vegetale, il virus del mosaico del tabacco (TMV) marcato con CFP. La Figura 3 mostra che, in entrambi i casi, le proteine co-espresse hanno mostrato un chiaro pattern di localizzazione del PD. Allo stesso modo, la colorazione istologica con blu all'anilina specifica per la PD dei tessuti che esprimono MP-EGFP o PDLP5-EGFP non ha rilevato alcuna interferenza con la localizzazione PD dei segnali EGFP e blu all'anilina (Figura 3).
Gli studi di localizzazione della malattia di Parkinson spesso beneficiano di una stima più quantitativa dell'espressione complessiva della proteina di riferimento e del segnale della malattia di Parkinson. Questo approccio di quantificazione è illustrato nella Figura 4 e nella Figura 5. Per la quantificazione dell'espressione generale, è stata misurata l'intensità del segnale di PDLP5 e MP. Entrambe le proteine hanno mostrato segnali forti in tutti i punti temporali di visualizzazione durante il periodo di 10 dpi, con un'intensità massima del segnale a 3 dpi per PDLP5 e a 2 dpi per MP (Figura 4). Non ci sono state differenze statisticamente significative nell'intensità del segnale tra PDLP5 e MP in nessuno dei punti temporali di visualizzazione. L'intensità del segnale PDCB1 ha mostrato una maggiore fluttuazione tra i punti temporali, con il segnale più forte osservato a 7 dpi (Figura 4), sebbene fosse difficile raccogliere dati statisticamente significativi in questo punto temporale a causa della scarsità di cellule esprimettenti. Pertanto, i primi 3 dpi rappresentano il momento ottimale per rilevare l'espressione di PDCB1. Come previsto, i campioni di colorazione con blu di anilina hanno mostrato un segnale più stabile rispetto alle proteine espresse transitoriamente (Figura 4).
I punti PD formati da PDLP5 e MP sono stati quindi quantificati. PDLP5 ha mostrato un numero stabile di puncta PD per tutto il periodo di osservazione, senza differenze statisticamente significative tra due dei punti temporali testati (Figura 5). Il numero più alto di PD puncta formati da MP è stato rilevato a 2 dpi, e sono rimasti relativamente stabili fino alla fine del periodo di osservazione. Il confronto dei numeri di PD puncta tra PDLP5 e MP non ha rivelato differenze statisticamente significative nella maggior parte dei momenti di campionamento (Figura 5). Anche il numero di puncta PD colorati con blu anilina è rimasto stabile, anche se è leggermente diminuito a 10 dpi. Il numero di punti PD decorati con blu anilina, PDLP5 o MP era simile tra loro con significatività statistica (Figura 5), coerentemente con la specificità PD di questi marcatori. I numeri di PD puncta per PDCB1 non sono stati analizzati perché, in punti temporali precedenti, il segnale PD era oscurato dal segnale ER e in punti temporali successivi è stato osservato solo in un numero relativamente basso di cellule (vedi Figura 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67378/67378fig01.jpg"> Figura 1: Localizzazione dei plasmodesmi (PD) di TVCV MP, PDLP5 e PDCB1 espressi transitoriamente in Nicotiana benthamiana e colorazione blu all'anilina del PD. (A) Localizzazione PD di MP-EGFP, PDLP5-EGFP e PDCB1-EGFP e colorazione all'anilina. Il segnale EGFP è in verde, il segnale blu all'anilina è in blu e l'autofluorescenza dei plastidi è in rosso. (B) Co-espressione di MP-EGFP, PDLP5-EGFP e PDCB1-EGFP con il marcatore del reticolo endoplasmatico (ER) marcato con mRFP. Le immagini sono state registrate a 2 giorni dopo l'infiltrazione (dpi) e sono singole sezioni confocali rappresentative di due esperimenti indipendenti (N = 20 immagini da 2 piante). Il segnale EGFP è in verde, il segnale mRFP è in viola e l'autofluorescenza dei plastidi è in rosso. Le frecce gialle indicano che PDCB1 è localizzato al reticolo endoplasmatico. Barre di scala = 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67378/67378fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67378/67378fig02.jpg"> Figura 2: Decorso temporale della localizzazione PD di TVCV MP, PDLP5 e PDCB1 espressi transitoriamente in Nicotiana benthamiana e della colorazione blu anilina del PD. Le immagini sono state registrate a 2 dpi e sono singole sezioni confocali rappresentative di due esperimenti indipendenti (N = 20 immagini da 2 piante per tutti i sistemi, tranne 7 dpi e 10 dpi per PDCB1-EGFP, in cui un minor numero di cellule ha mostrato il segnale). Il segnale EGFP è in verde e il segnale blu all'anilina è in blu. Barre della scala = 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67378/67378fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67378/67378fig03.jpg"> Figura 3: TVCV MP e PDLP5 mantengono la loro localizzazione PD dopo la co-espressione con un TMV MP che localizza PD e la coina con blu anilina. Le immagini sono state registrate a 2 dpi e sono singole sezioni confocali rappresentative di N ≥ 10 immagini da 4-6 piante. Il segnale EGFP è in verde, il segnale CFP e il segnale blu all'anilina sono in blu e l'autofluorescenza dei plastidi è in rosso. Barre della scala = 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67378/67378fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67378/67378fig04.jpg"> Figura 4: Decorso temporale dell'intensità di fluorescenza di TVCV MP, PDLP5 e PDCB1 espressa transitoriamente in Nicotiana benthamiana e colorazione PD con blu di anilina. I dati quantitativi sono stati raccolti dagli esperimenti descritti nella Figura 2. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard della media da più esperimenti. I singoli punti dati sono indicati come media per ogni misurazione. Le differenze tra i valori medi valutati mediante ANOVA a due vie con il test di confronto multiplo di Tukey sono statisticamente significative per i valori P. *P &lt; 0,05, **P &lt; 0,01 e ***P &lt; 0,001, ****P &lt; 0,0001; ns, non statisticamente significativo. Barre blu, colorazione all'anilina; barre verde chiaro, MP-EGFP, barre verde scuro, PDLP5-EGFP; barre gialle, PDCB1-EGFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67378/67378fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67378/67378fig05.jpg"> Figura 5: Decorso temporale della formazione dei punti PD da parte di TVCV, MP e PDLP5 espressi transitoriamente in Nicotiana benthamiana e mediante colorazione blu all'anilina del PD. I dati quantitativi sono stati raccolti dagli esperimenti descritti nella Figura 2. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard della media da più esperimenti. I singoli punti dati sono indicati come media per ogni misurazione. Le differenze tra i valori medi valutati mediante ANOVA a due vie con il test di confronto multiplo di Tukey sono statisticamente significative per i valori P. *P &lt; 0,05, **P &lt; 0,01, ***P &lt; 0,001, ****P &lt; 0,0001. Barre blu, colorazione all'anilina; barre verde chiaro, MP-EGFP, barre verde scuro, PDLP5-EGFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67378/67378fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td colspan="4">Esperimento I</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Totale celle</td>
			<td>Cellule con localizzazione PD</td>
			<td>Celle con segnale misto</td>
			<td>Cellule con localizzazione PD (%)</td>
		</tr><tr><td>Blu anilina</td>
			<td>40</td>
			<td>40</td>
			<td>4</td>
			<td>100</td>
		</tr><tr><td>MP-EGFP</td>
			<td>40</td>
			<td>40</td>
			<td>4</td>
			<td>100</td>
		</tr><tr><td>PDCB1-EGFP</td>
			<td>40</td>
			<td>3</td>
			<td>38</td>
			<td>7.5</td>
		</tr><tr><td>PDLP5-EGFP</td>
			<td>40</td>
			<td>40</td>
			<td>0</td>
			<td>100</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td colspan="4">Esperimento II</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Totale celle</td>
			<td>Cellule con localizzazione PD</td>
			<td>Celle con segnale misto</td>
			<td>Cellule con localizzazione PD (%)</td>
		</tr><tr><td>Blu anilina</td>
			<td>40</td>
			<td>40</td>
			<td>8</td>
			<td>100</td>
		</tr><tr><td>MP-EGFP</td>
			<td>40</td>
			<td>39</td>
			<td>8</td>
			<td>97.5</td>
		</tr><tr><td>PDCB1-EGFP</td>
			<td>40</td>
			<td>12</td>
			<td>31</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>PDLP5-EGFP</td>
			<td>40</td>
			<td>39</td>
			<td>2</td>
			<td>97.5</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Efficienza della localizzazione PD.
Figura 1 supplementare: Localizzazione PD di TVCV MP, PDLP5 e PDCB1 espressi transitoriamente in Nicotiana benthamiana. Le immagini sono state registrate a 5 dpi (A), 7 dpi (B) e 10 dpi (C). Il segnale EGFP è verde e l'autofluorescenza del plastide è rossa. Barre di scala = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67378/Figure%20S1.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

Analisi al microscopio confocale dello smistamento delle proteine in Plasmodesmata in Nicotiana benthamiana

Plasmodesmata are membranous nanopores that connect the cytoplasm of adjacent plant cells and enable the cell-to-cell trafficking of nutrients, ...

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Biologia

Traffico macromolecolari tra le cellule delle piante può essere valutata transitoriamente esprimere una proteina fluorescente-tagged di interesse e per analizzarne la distribuzione intra-ed intercellulare mediante microscopia confocale.

Una cellula-cellula Macromolecole saggio di trasporto In Planta Utilizzando Bombardamento Biolistic

Abbiamo sviluppato una tecnica per testare interazioni proteina-proteina in pianta. Una proteina fluorescente gialla (YFP) è divisa in due frammenti non si sovrappongono. Ogni frammento viene clonato in-frame ad un gene di interesse attraverso il sistema Gateway, consentendo l'espressione di proteine ​​di fusione. Ricostituzione del segnale YFP si verifica solo quando le proteine ​​interagiscono inchiesta.

Rilevamento delle interazioni proteiche in pianta utilizzando un gateway compatibile complementazione fluorescenza biomolecolare (BiFC) Sistema

Cella di analisi specifica di<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Foglie usando fluorescenza activated cell sorting

Formazione di complessi proteici in vivo può essere visualizzato da bimolecular fluorescenza complementazione. Partner di interazione sono fusi a parti complementari tag fluorescenti e transitoriamente espressi in foglie di tabacco, risultando in un segnale fluorescente ricostituito upon vicinanza delle due proteine.

Interazioni proteina-proteina visualizzati tramite bimolecular complementazione fluorescenza in protoplasti di tabacco e foglie

A livello subcellulare, gli eventi di segnalazione sono modulati dinamicamente da segnali di sviluppo e ambientali. Qui descriviamo un protocollo che impiega il sistema di espressione transitoria del tabacco per monitorare l'interazione dinamica proteina-proteina e per rivelare l'organizzazione spaziale della trasduzione del segnale nelle cellule vegetali.

Imaging Riorganizzazione spaziale di una via di segnalazione MAPK Utilizzando il sistema transitorio Expression Tabacco

Connessioni intercellulari di pianta, la Plasmodesmi (Pd), giocano un ruolo centrale nella pianta interazioni pianta-virus e di fisiologia. Critica ai trasporti Pd sono smistamento segnali che indirizzano proteine al Pd. Tuttavia, la nostra conoscenza di queste sequenze è ancora nella sua infanzia. Descriviamo una strategia per identificare i segnali di localizzazione di Pd in proteine Pd-mirati.

Identificazione di sequenze di localizzazione Plasmodesmal in proteine In Planta

Questo manoscritto descrive una facile e rapida procedura sperimentale per la determinazione di interazioni proteina-proteina basate sulla misurazione dell'attività luciferasica.

Analisi di Imaging di complementazione di luciferase in foglie di Nicotiana benthamiana per transitoriamente determinare dinamiche di interazione proteina-proteina

Abbiamo sviluppato un nuovo metodo per cheesprimono più proteine di fusione fluorescenti chimerico in piante per superare le difficoltà dei metodi convenzionali. Essa si avvale dell'utilizzo di un plasmide di espressione singola che contiene più proteine funzionalmente indipendente esprimendo cassette per ottenere co-espressione della proteina.

Co-espressione delle proteine chimeriche fluorescenti Fusion Multiple in modo efficiente nelle piante

Questo protocollo presenta come immagine live e analizzare i meristemi apicali di sparare da specie diverse di piante mediante microscopia confocale a scansione laser.

Formazione immagine confocal Live dei meristemi apicali riprese da diverse specie di piante

Descritto qui è un metodo di etichettatura di prossimità per l'identificazione dei partner di interazione del dominio TIR del recettore immunitario NLR nel tessuto fogliare di Nicotiana benthamiana. Viene inoltre fornito un protocollo dettagliato per l'identificazione delle interazioni tra altre proteine di interesse utilizzando questa tecnica nella Nicotiana e in altre specie vegetali.

Etichettatura di prossimità basata su turboid per in Planta identificazione di reti di interazione proteina-proteina

I primordi delle foglie di mais sono profondamente inguainati e arrotolati, rendendoli difficili da studiare. Qui presentiamo metodi per la preparazione di sezioni trasversali e supporti interi srotolati di primordi di foglie di mais per la fluorescenza e l'imaging confocale.

Metodi migliorati per la preparazione di sezioni trasversali e supporti interi srotolati di Primordia di foglie di mais per fluorescenza e imaging confocale

Scopri l'analisi al microscopio confocale dello smistamento delle proteine nei plasmodesmi di Nicotiana benthamiana durante le interazioni virali. Questo metodo rivela la dinamica di localizzazione di PDLP5 e TVCV MP.

Analisi al microscopio confocale dello smistamento delle proteine in Plasmodesmata in Nicotiana benthamiana

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