Valutazione del rilascio di LC3-II attraverso vescicole extracellulari in relazione all'accumulo di vescicole intracellulari LC3-positive
18 ottobre 2024
Qui, presentiamo la metodologia per valutare in modo conciso i livelli di LC3-II del marcatore autofagosomico nelle vescicole extracellulari (EV) mediante immunoblotting. L'analisi dei livelli di LC3-II nelle vescicole extracellulari, nella formazione di autolisosomi e nella formazione di omegasomi suggerisce il nuovo ruolo di STX6 nel rilascio di vescicole extracellulari LC3-II positive quando la fusione autofagosoma-lisosoma è inibita.
La nostra ricerca si concentra sulle malattie neurodegenerative progressive caratterizzate dall'accumulo della proteina nucleare TDP-43 nel citoplasma, come la SLA o la FTLD-TDP. Il nostro obiettivo è capire come le patologie della TDP-43 si diffondano nel cervello in modo simile ai prioni. In precedenza abbiamo scoperto che il rilascio di TDP-43 attraverso le vescicole extracellulari è mediato dalla disregolazione dell'autofagia.
La progranulina del FTLD-TDP facilita questo processo. La prossima sfida è chiarire come l'autofagia regoli la produzione e il rilascio di vescicole extracellulari contenenti TDP-43, il che potrebbe portare alla scoperta di bersagli terapeutici per la SLA o FTLD-TDP. Per iniziare, prendi le cellule HeLa coltivate, contale usando un contatore di cellule e semina una volta dieci alla potenza di sei cellule su una piastra di sei centimetri contenente un terreno di coltura.
Incubare le cellule a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica e umidità controllata per 24 ore. Successivamente, preparare una soluzione di siRNA da 20 micromolari. Mescolare 100 microlitri di terreno sierico ridotto e tre microlitri di siRNA in una provetta a bassa ritenzione per preparare la soluzione A.Quindi, mescolare 100 microlitri di terreno sierico ridotto e cinque microlitri di reagente di trasfezione in una provetta a bassa ritenzione per preparare la soluzione B.Successivamente, mescolare la soluzione A e la soluzione B, quindi incubare la miscela a temperatura ambiente per cinque minuti.
Aggiungere ora la miscela delle soluzioni A e B al terreno utilizzato per la coltura delle cellule HeLa e incubare per 24 ore. Il giorno successivo, lavare le cellule con PBS ed esporre le cellule a 500 microlitri di tripsina allo 0,25% e una soluzione millimolare di EDTA a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica e umidità controllata per cinque minuti. Successivamente, aggiungere 2,5 millilitri di terreno di coltura alle cellule e, utilizzando una pipetta di trasferimento Pasteur con un puntale da 20 microlitri attaccato, preparare una sospensione a cellula singola.
Dopo aver contato le cellule, seminare una volta dieci alla potenza di sei cellule su una piastra di dieci centimetri e incubare, come dimostrato in precedenza. Al termine dell'incubazione, preparare il terreno di coltura contenente veicolo o 100 nanomolari di bafilomicina A1. Quindi esporre le cellule al terreno contenente veicolo o 100 nanomolari di bafilomicina A1 e incubare per 24 ore. Il giorno seguente, raccogli tutto il terreno di coltura dalla piastra da 10 centimetri.
Trasferire il terreno raccolto in una provetta da 15 millilitri e centrifugarlo a 3.000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius per rimuovere i detriti cellulari. Per isolare la frazione di vescicola extracellulare P1, trasferire il surnatante dopo centrifugazione a 3.000 G in una provetta da centrifugazione. Centrifugare la provetta a 20.000 G a quattro gradi Celsius per un'ora.
Per l'isolamento della frazione di vescicola extracellulare P2, trasferire il surnatante dopo centrifugazione a 20.000 G in una provetta da ultracentrifuga. Centrifugare a 110.000 g a quattro gradi Celsius per un'ora. Dopo aver rimosso l'umidità in eccesso all'interno della provetta con un panno da laboratorio, risospendere i pellet rimanenti nella provetta da centrifugazione in 50 microlitri di tampone campione a due tempi per preparare la frazione di vescicola extracellulare P1.
Quindi rimuovere il surnatante mediante travaso. Rimuovere l'umidità in eccesso all'interno della provetta con un panno da laboratorio e risospendere i pellet rimanenti nella provetta per ultracentrifugazione in 50 microlitri di tampone campione due volte per preparare la frazione di vescicola extracellulare P2. Incubare le frazioni di vescicole extracellulari P1 e P2 a 100 gradi Celsius su un blocco termico per 10 minuti.
Dopo aver trasferito il terreno di coltura dalla piastra da 10 centimetri in una provetta da 15 millilitri, lavare le cellule nella piastra da 10 centimetri con PBS. Quindi esporre le cellule a due millilitri di tripsina allo 0,25% e a una soluzione millimolare di EDTA a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica e umidità controllata per cinque minuti. Aggiungi otto millilitri di terreno di coltura alle cellule.
Utilizzando una pipetta di trasferimento Pasteur con un puntale da 200 microlitri attaccato, pipettare le cellule per preparare una sospensione a cellula singola. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 millilitri e centrifugarla a 1.000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi rimuovere il surnatante utilizzando un aspiratore.
Aggiungere il PBS al pellet della cella e centrifugare a 1.000 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver rimosso il PBS, sonicare il pellet cellulare in un millilitro di tampone A68 contenente l'1% di sarco. Miscelare 300 microlitri di lisato cellulare con 100 microlitri di tampone campione quattro volte.
Incubare la miscela a 100 gradi Celsius su un blocco termico per 10 minuti per preparare la frazione cellulare.
Panoramica
Questo studio indaga il ruolo della TDP-43 nelle malattie neurodegenerative e il suo rilascio tramite vescicole extracellulari (EV). La ricerca evidenzia il coinvolgimento dell'autofagia nella regolazione del rilascio della TDP-43, aprendo la strada a potenziali bersagli terapeutici per la SLA e la FTLD-TDP.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Malattie neurodegenerative
Sfondo
- La TDP-43 è una proteina nucleare associata a malattie neurodegenerative.
- La SLA e la FTLD-TDP sono caratterizzate dall'accumulo di TDP-43 nel citoplasma.
- La comprensione della patologia della TDP-43 potrebbe rivelare i meccanismi di diffusione della malattia.
- Le vescicole extracellulari svolgono un ruolo nel rilascio della TDP-43.
Scopo dello studio
- Chiarire come l'autofagia regola la produzione e il rilascio di vescicole extracellulari contenenti TDP-43.
- Esplorare potenziali bersagli terapeutici per la SLA e la FTLD-TDP.
- Indagare il ruolo della progranulina nel rilascio di TDP-43.
Metodi Utilizzati
- Coltura cellulare di cellule HeLa.
- Conteggio delle cellule utilizzando un contatore cellulare.
- Seeding delle cellule in mezzo di coltura per l'esperimento.
- Immunoblotting per valutare i livelli dei marcatori degli autofagosomi.
Risultati principali
- Identificazione del ruolo di STX6 nel rilascio di EV positivi per LC3-II.
- Analisi degli effetti dell'inibizione della fusione tra autofagosoma e lisosoma.
- Evidenza di una disregolazione dell'autofagia nel rilascio di TDP-43.
- Facilitazione da parte della progranulina del rilascio di TDP-43 mediante EV.
Conclusioni
- L'autofagia è fondamentale per la regolazione del rilascio di TDP-43.
- Il targeting dell'autofagia potrebbe offrire nuove vie terapeutiche per la SLA e la FTLD-TDP.
- Sono necessarie ulteriori ricerche per comprendere appieno i meccanismi coinvolti.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La valutazione quantitativa del rilascio di LC3-II tramite vescicole extracellulari (EV) fornisce una finestra meccanicistica sul traffico proteico dipendente dall'autofagia, un processo implicato nella progressione delle malattie neurodegenerative. Questo protocollo consente ai team biofarmaceutici di analizzare i determinanti molecolari della disseminazione patologica delle proteine, sostenendo la validazione degli obiettivi terapeutici e l'avanzamento calibrato sul rischio nei portafogli dedicati alle neurodegenerazioni. L'approccio rafforza la fiducia predittiva nel punto di intersezione tra modulazione dell'autofagia e rilascio di biomarcatori mediato da EV.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Consente la valutazione funzionale di geni legati all'autofagia nell'esportazione proteica mediata da EV.
- Permette una riduzione del rischio meccanicistica isolando l'impatto di bersagli candidati come STX6 sul traffico di LC3-II.
- Facilita l'indagine basata su ipotesi riguardo i percorsi rilevanti per le malattie nella neurodegenerazione.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce un flusso di lavoro riproducibile basato sull'immunoblot per la quantificazione di LC3-II in frazioni cellulari e di EV.
- Stabilisce controlli del saggio mediante bafilomicina A1 per valutare l'inibizione della fusione autofagosoma-lisosoma.
- Consente la standardizzazione dell'isolamento di EV e della quantificazione dei marcatori per applicazioni di screening successive.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea alle strategie traslazionali di biomarcatori quantificando la LC3-II associata alle vescicole extracellulari (EV) in condizioni di perturbazione rilevanti per la malattia.
- Permette un percorso continuo dalla scoperta meccanicistica alla validazione preclinica di interventi che modulano l'autofagia.
- Fornisce una piattaforma per valutare la disseminazione extracellulare di proteine patologiche in modelli di malattie neurodegenerative.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo si integra nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, consentendo letture quantitative e meccanicistiche dell'autofagia e della biologia delle vescicole extracellulari.
- Biologia della scoperta: Supporta il test dell'ipotesi nulla per geni bersaglio che regolano l'esportazione di LC3-II tramite EV.
- Screening: Fornisce output standardizzati e quantitativi di immunoblot per analisi comparative tra diverse condizioni.
- Analisi: Consente la misurazione di LC3-II e TSG101 come marcatori ortogonali per la specificità del percorso e delle vescicole.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati meccanicistici a modelli rilevanti per le malattie legate all'aggregazione e alla diffusione delle proteine.
- Riutilizzo aziendale: Offre un flusso di lavoro modulare adattabile a diversi programmi di ricerca sull'autofagia e sugli EV.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli bersagli per i percorsi di autofagia e di EV.
- Valore operativo: Standardizza l'isolamento degli EV e la quantificazione di LC3-II per studi riproducibili e scalabili.
- Valore strategico: Informa le decisioni di avanzamento o interruzione per bersagli legati alla neurodegenerazione, chiarificando i ruoli meccanicistici nella disseminazione proteica.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata al rischio di candidati che modulano l'autofagia nei percorsi per le malattie neurodegenerative.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'ambito della coltura cellulare, della transfezione con siRNA e delle tecniche di immunoblotting.
- Richiede l'accesso a infrastrutture per centrifugazione ad alta velocità e ultracentrifugazione per l'isolamento degli EV.
- Necessita di una rigorosa standardizzazione intersettoriale della preparazione dei campioni e della quantificazione dei marcatori.
- È adattabile a diversi modelli cellulari, ma potrebbe richiedere un'ottimizzazione per sistemi primari o rilevanti per patologie.
- L'interpretazione dei risultati relativi a LC3-II e TSG101 deve tenere conto della specificità del percorso e dei controlli sperimentali.
