Name: Valutazione del rilascio di LC3-II attraverso vescicole extracellulari in relazione allaccumulo di vescicole intracellulari LC3-positive (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-18T14:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: Scopri come l'autofagia regola il rilascio di TDP-43 attraverso vescicole extracellulari in cellule HeLa. Questo metodo aiuta a identificare nuove strategie terapeutiche per ALS e FTLD-TDP.

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<meta charset="utf8"></head><body>Valutazione del rilascio di EV LC3-II-positivo nell'autofagia con fusione lisosomiale compromessa

<ol><li>Tanaka, Y., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profilin+1+mutants+form+aggregates+that+induce+accumulation+of+prion-like+tdp-43%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Profilin 1 mutants form aggregates that induce accumulation of prion-like tdp-43.</a> Prion. 10 (4), 283-289 (2016).</li>
<li>Mehta, P. R., Brown, A. L., Ward, M. E., Fratta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+era+of+cryptic+exons%3A+Implications+for+als-ftd%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">The era of cryptic exons: Implications for als-ftd.</a> Mol Neurodegener. 18 (1), 16(2023).</li>
<li>Kawakami, I., Arai, T., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basis+of+clinicopathological+heterogeneity+in+tdp-43+proteinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">The basis of clinicopathological heterogeneity in tdp-43 proteinopathy.</a> Acta Neuropathol. 138 (5), 751-770 (2019).</li>
<li>Chatterjee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+extracellular+vesicle+tau+and+tdp-43+as+diagnostic+biomarkers+in+ftd+and+als%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Plasma extracellular vesicle tau and tdp-43 as diagnostic biomarkers in ftd and als.</a> Nat Med. 30 (6), 1771-1783 (2024).</li>
<li>Kasai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+use+of+csf+nfl+and+csf+tdp-43+improves+diagnostic+performance+in+als%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Clin+Transl+Neurol%22%5BJournal%5D)">Combined use of csf nfl and csf tdp-43 improves diagnostic performance in als.</a> Ann Clin Transl Neurol. 6 (12), 2489-2502 (2019).</li>
<li>Iguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+secretion+is+a+key+pathway+for+clearance+of+pathological+tdp-43%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Exosome secretion is a key pathway for clearance of pathological tdp-43.</a> Brain. 139 (Pt 12), 3187-3201 (2016).</li>
<li>Ding, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+to+als-ftd-csf+generates+tdp-43+aggregates+in+glioblastoma+cells+through+exosomes+and+tnts-like+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Exposure to als-ftd-csf generates tdp-43 aggregates in glioblastoma cells through exosomes and tnts-like structure.</a> Oncotarget. 6 (27), 24178-24191 (2015).</li>
<li>Mizushima, N., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Autophagy in human diseases.</a> N Engl J Med. 383 (16), 1564-1576 (2020).</li>
<li>Sasaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+spinal+cord+motor+neurons+in+sporadic+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Autophagy in spinal cord motor neurons in sporadic amyotrophic lateral sclerosis.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 70 (5), 349-359 (2011).</li>
<li>Ling, S. C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Converging+mechanisms+in+als+and+ftd%3A+Disrupted+rna+and+protein+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Converging mechanisms in als and ftd: Disrupted rna and protein homeostasis.</a> Neuron. 79 (3), 416-438 (2013).</li>
<li>Nguyen, D. K. H., Thombre, R., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+as+a+common+pathway+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Autophagy as a common pathway in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Neurosci Lett. 697, 34-48 (2019).</li>
<li>Tanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+involvement+of+lysosomal+dysfunction+in+pathological+changes+of+the+brain+in+aged+progranulin-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol+Commun%22%5BJournal%5D)">Possible involvement of lysosomal dysfunction in pathological changes of the brain in aged progranulin-deficient mice.</a> Acta Neuropathol Commun. 2, 78(2014).</li>
<li>Tanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+the+progranulin-driven+autophagy-lysosomal+pathway+mediates+secretion+of+the+nuclear+protein+tdp-43%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of the progranulin-driven autophagy-lysosomal pathway mediates secretion of the nuclear protein tdp-43.</a> J Biol Chem. 299 (11), 105272(2023).</li>
<li>Tanaka, Y., Ito, S., Suzuki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+secretion+via+extracellular+vesicles+is+regulated+by+macroautophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy+Rep%22%5BJournal%5D)">TDP-43 secretion via extracellular vesicles is regulated by macroautophagy.</a> Autophagy Rep. 3 (1), (2024).</li>
<li>Ratajczak, M., Ratajczak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+microvesicles%2Fexosomes%3A+discovery%2C+disbelief%2C+acceptance%2C+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Extracellular microvesicles/exosomes: discovery, disbelief, acceptance, and the future.</a> Leukemia. 34 (12), 3126-3135 (2020).</li>
<li>Tanaka, Y., Kozuma, L., Hino, H., Takeya, K., Eto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abemaciclib+and+vacuolin-1+decrease+aggregate-prone+tdp-43+accumulation+by+accelerating+autophagic+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Rep%22%5BJournal%5D)">Abemaciclib and vacuolin-1 decrease aggregate-prone tdp-43 accumulation by accelerating autophagic flux.</a> Biochem Biophys Rep. 38, 101705(2024).</li>
<li>Dingjan, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+and+phagosomal+snares%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Endosomal and phagosomal snares.</a> Physiol Rev. 98 (3), 1465-1492 (2018).</li>
<li>Tanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progranulin+regulates+lysosomal+function+and+biogenesis+through+acidification+of+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Progranulin regulates lysosomal function and biogenesis through acidification of lysosomes.</a> Hum Mol Genet. 26 (5), 969-988 (2017).</li>
<li>Kanda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+freely+available+easy-to-use+software+%27EZR%27+for+medical+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transpl%22%5BJournal%5D)">Investigation of the freely available easy-to-use software 'EZR' for medical statistics.</a> Bone Marrow Transpl. 48 (3), 452-458 (2013).</li>
<li>Cookson, N. A., Cookson, S. W., Tsimring, L. S., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle-dependent+variations+in+protein+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Cell cycle-dependent variations in protein concentration.</a> Nucleic Acids Res. 38 (8), 2676-2681 (2010).</li>
<li>Plate, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+proteostasis+regulators+that+reprogram+the+ER+to+reduce+extracellular+protein+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Small molecule proteostasis regulators that reprogram the ER to reduce extracellular protein aggregation.</a> eLife. 5, e15550(2016).</li>
<li>Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mammalian+autophagy+in+protein+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Jpn+Acad+Ser+B+Phys+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">The role of mammalian autophagy in protein metabolism.</a> Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 83 (2), 39-46 (2007).</li>
<li>Nanayakkara, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagic+lysosome+reformation+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagic lysosome reformation in health and disease.</a> Autophagy. 19 (5), 1378-1395 (2023).</li>
<li>Nozawa, T., Minowa-Nozawa, A., Aikawa, C., Nakagawa, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+STX6-VTI1B-VAMP3+complex+facilitates+xenophagy+by+regulating+the+fusion+between+recycling+endosomes+and+autophagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">The STX6-VTI1B-VAMP3 complex facilitates xenophagy by regulating the fusion between recycling endosomes and autophagosomes.</a> Autophagy. 13 (1), 57-69 (2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0,25 % Tripsina EDTA</td><td>Fujifilm Wako</td><td>201-16945</td><td></td></tr><tr><td>Piatto da 10 cm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150464</td><td></td></tr><tr><td>Tubo da 15 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; L Pipetta Tip</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-301</td><td>pipettaggio</td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanolo</td><td>Nacalai Tesque</td><td>21417-52</td><td>un materiale per soluzione tampone campione</td></tr><tr><td>3,3'-Diaminobenzidina Tetracloridrato</td><td>Nacalai Tesque</td><td>11009-41</td><td>un materiale per soluzione DAB</td></tr><tr><td>3,5 cm Piatto&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150460</td><td></td></tr><tr><td>Piatto da 6 cm&nbsp;</td><td>TrueLine</td><td>TR4001</td><td></td></tr><tr><td>Bagni termostatici a blocchi di alluminio (termobagni a secco)</td><td>EYELA</td><td>273860</td><td></td></tr><tr><td>Aspiratore</td><td>SANSYO</td><td>SAP-102</td><td>soluzione di inalazione</td></tr><tr><td>Avanti JXN-30</td><td>Beckman Coulter</td><td>B34193</td><td></td></tr><tr><td>Bafilomicina A1</td><td>Adipogen</td><td>BVT-0252</td><td></td></tr><tr>Capra<td>coniugata con biotina Anticorpo IgG di coniglio</td><td> Laboratori&nbsp;</td><td>BA-1000</td><td>2° anticorpo per immunoblotting</td></tr><tr>Laboratorio di<td>anticorpi IgG di cavallo coniugati con biotina</td><td>&nbsp;</td><td>BA-2000</td><td>2° anticorpo per l'immunoblotting</td></tr><tr><td>Blocking One</td><td>Nacalai Tesque</td><td>03953-95</td><td>un materiale per l'immunoblotting</td></tr><tr><td>Bromophenol Blue</td><td>Nacalai Tesque</td><td>05808-61</td><td>un materiale per soluzione tampone del campione</td></tr><tr><td>Siero di vitello</td><td>cytiva</td><td>SH30073.03</td><td></td></tr><tr><td>CanoScan LiDE 220</td><td>Canon</td><td>CSLIDE220</td><td>Scanner</td></tr><tr><td>Centrifuga 5702 R</td><td>eppendolf</td><td>5703000039</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini di conteggio Doppia camera</td><td>Bio-Rad</td><td>1450015J</td><td>Conteggio cellulare</td></tr><tr><td>Sonificatore digitale 450</td><td>BRANSON</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide</td><td>nacalai tasque</td><td>09659-14</td><td>veicolo</td></tr><tr><td>DMEM Alto glucosio</td><td>Nacalai Tesque</td><td>08458-45</td><td>terreno di coltura</td></tr><tr><td>DMEM senza fenolo rosso</td><td>Nacalai Tesque</td><td>08489-45</td><td>terreno di coltura</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Dojindo&nbsp;</td><td>348-01311</td><td>un materiale per la soluzione A68</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>versione 16.16.27</td><td>analisi satistica</td></tr><tr><td>EZR</td><td>Numero di riferimento 24</td><td>versione 1.68</td><td>analisi satistica</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma</td><td>173012</td><td>Terreno di coltura</td></tr><tr><td>Fiji</td><td>NIH</td><td></td><td>Strumento di analisi delle immagini</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Nacalai Tesque</td><td>09886-05</td><td>un materiale per soluzione tampone campione</td></tr><tr><td>Hoehst33342</td><td>Dojindo&nbsp;</td><td>H342</td><td></td></tr><tr><td>Perossido di idrogeno</td><td>Fujifilm Wako</td><td>080-0186</td><td>un materiale per la soluzione DAB</td></tr><tr><td>Kimwipe S-200</td><td>NIPPON PAPER CRECIA</td><td>62011</td><td>salvietta detergente</td></tr><tr><td>Tubo a bassa ritenzione</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-MCT015CLB</td><td>siRNA e trasfezione del DNA</td></tr><tr><td>LSM780 Microscopio laser confocale</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monoclonale Mouse Anti-LC3 Anticorpo</td><td>MBL</td><td>M186-3</td><td>1° anticorpo per immunoblotting</td></tr><tr><td>Cloruro di nichel (II) esaidrato</td><td>Fujifilm Wako</td><td>149-01041</td><td>un materiale per soluzione DAB</td></tr><tr><td>N-Lauroilsarcosina Sale di sodio</td><td>Nacalai Tesque</td><td>20117-12</td><td></td></tr><tr><td>Optima XE-90 Ultracentrifuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>A94471</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Siero ridotto Medium Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>31985-070</td><td>siRNA e trasfezione del DNA</td></tr><tr><td>pEGFP-C1-hAtg13</td><td>Addgene</td><td>22875</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Nacalai Tesque</td><td>26253-84</td><td>Terreno di coltura</td></tr><tr><td>Kit di analisi delle proteine BCA Pierce</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-PCNA di coniglio policlonale</td><td>BioAcademia</td><td>70-080</td><td>1° anticorpo per immunoblotting</td></tr> Anticorpo <tr><td>policlonale di coniglio anti-sintassina 6</td><td>ProteinTech</td><td>10841-1-AP</td><td>1° anticorpo per immunoblotting</td></tr><tr><td>Anticorpo policlonale di coniglio anti-TSG101 ProteinTech</td><td></td><td>28283-1-AP</td><td>1° anticorpo per immunoblotting</td></tr><tr><td>Anticorpo policlonale di coniglio anti-ULK1</td><td>ProteinTech</td><td>20986-1-AP</td><td>1° anticorpo per immunoblotting</td></tr><tr><td>Polivinilidene difluoruro Membrana</td><td>Milliore</td><td>IPVH00010</td><td>un materiale per l'immunoblotting</td></tr><tr><td>R</td><td>R sviluppo core team</td><td>versione 4.4.1</td><td>analisi satistica</td></tr><tr><td>RNAiMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13778</td><td>siRNA reagente di trasfezione</td></tr><tr><td>siRNA STX6</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HSS115604</td><td>siRNA per trasfezione</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Nacalai Tesque</td><td>31320-05</td><td>un materiale per tampone Tris e soluzione A68</td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate</td><td>Fujifilm Wako</td><td>192-13981</td><td>un materiale per soluzione tampone campione</td></tr><tr><td>SPARK Microplate Reader TECAN</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stealth RNAi Negative Control Duplexes, Med GC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12935300</td><td>trasfezione siRNA</td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Fujifilm Wako</td><td>193-00025</td><td>un materiale per la soluzione A68</td></tr><tr><td>TC20 Contatore di cellule automatizzato con stampante termica</td><td>Bio-Rad</td><td>1450109J1</td><td>conteggio delle cellule</td></tr><tr><td>Thermobath</td><td>TOKYO RIKAKIKAI</td><td>MG-3100</td><td>incubazione</td></tr><tr><td>TransIT-293</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR 2700</td><td>Reagente di trasfezione del DNA</td></tr><tr><td>TransIT-LT1</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR2300</td><td>Reagente</td></tr> <tr><td>di trasfezione del DNATris(idrossimetil)amminometano</td><td>Nacalai Tesque</td><td>35406-75</td><td>un materiale per tampone Tris, tampone per campioni e soluzione A68</td></tr><tr><td>Colorante blu di tripano 0,40%</td> <td>Bio-Rad</td><td>1450021</td><td>conteggio delle cellule</td></tr><tr><td>Tubo aperto ultratrasparente, 16 x 96 mm&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>361706</td><td>raccolta per la frazione P1 EV</td></tr><tr><td>Ultra-Clear Tube, 14 x 89mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td>raccolta per la frazione P2 EV</td></tr><tr><td>Vectastain ABC Standard Kit</td><td>Vector Laboratories&nbsp;</td><td>PK-4000</td><td>immunoblotting</td></tr><tr><td>bottiglia di lavaggio</td><td>come uno</td><td>membrana di lavaggio 1-4640-02</td><td></td></tr> &<tr><td>mu;-Slide 8 pozzo alto</td><td>ibidi</td><td>80806</td><td></td></tr></tbody></table>

valutazione del rilascio di lc3-ii attraverso vescicole extracellulari in relazione all'accumulo di vescicole intracellulari lc3-positive

Evaluation of LC3-II Release via Extracellular Vesicles in Relation to the Accumulation of Intracellular LC3-positive Vesicles

Come mostrato in studi precedenti, il trattamento con Baf ha aumentato i livelli di TSG101 (P1: P &lt; 0,01, P2: P = 0,012, come determinato dall'ANOVA a due vie in EZR19) e LC3-II (P1: P &lt; 0,01, P2: P &lt; 0,01, come determinato dall'ANOVA a due vie in EZR19) nella frazione ricca di EV. In particolare, il trattamento con Baf ha anche aumentato i livelli di STX6 (P1: P &lt; 0,01, P2: P &lt; 0,01, come determinato dall'ANOVA a due vie in EZR19) nella frazione EV (Figura 1A), suggerendo che STX6 potrebbe essere un componente delle EV. L'antigene nucleare delle cellule proliferanti (PCNA) non è stato osservato nella frazione EV. L'immunoblotting di STX6 nella frazione cellulare ha rivelato che i livelli di STX6 diminuivano della metà con il suo knockdown del siRNA (Figura 1B). Il knockdown di STX6 non ha influenzato i livelli di TSG101 nelle frazioni cellulari e EV sia in condizioni trattate con veicolo che con Baf (Figura 1C). Tuttavia, il knockdown di STX6 ha aumentato i livelli di LC3-II nella frazione cellulare nella condizione trattata con veicolo, ma non nella condizione trattata con Baf. Il knockdown di STX6 ha anche aumentato i livelli di LC3-II nella frazione EV in condizioni trattate con Baf (Figura 1D). Questi risultati suggeriscono che i metodi utilizzati per rilevare LC3-II nelle vescicole extracellulari mediante immunoblotting sono sufficientemente sensibili, anche se l'efficienza di knockdown non è sostanziale. Inoltre, questi risultati indicano che il knockdown di STX6 aumenta il numero di autofagosomi intracellulari e migliora il rilascio extracellulare di vescicole associate agli autofagosomi durante il trattamento con Baf.
Per indagare ulteriormente se il knockdown di STX6 influenza il numero intracellulare di autofagosomi e autolisosomi, gli autofagosomi e i lisosomi sono stati visualizzati utilizzando il marcatore autofagosomico mCherry-LC3 e il marcatore lisosomiale LAMP1-GFP. L'imaging confocale su cellule vive ha rivelato vescicole GFP- e mCherry-positive nelle cellule HeLa che esprimono LAMP1-GFP e mCherry-LC3 (Figura 2A). Gli autolisosomi sono stati identificati come vescicole GFP- e mCherry-positive, mentre gli autofagosomi sono stati identificati come vescicole GFP-negative e mCherry-positive. Il knockdown di STX6 ha aumentato il numero di autofagosomi e autolisosomi nella condizione trattata con il veicolo (Figura 2B, C). Tuttavia, il knockdown di STX6 non ha influenzato il numero di autofagosomi e autolisosomi nella condizione trattata con Baf (Figura 2B, C).
Per determinare se l'aumento del numero di autofagosomi intracellulari dovuto al knockdown di STX6 derivasse da una maggiore formazione di autofagosomi, la formazione di omegasomi, un processo necessario per la formazione di autofagosomi, è stata esaminata utilizzando l'intensità del segnale GFP-ATG13 del marcatore omegasoma. L'imaging confocale su cellule vive ha fornito un'immagine assemblata di GFP-ATG13, indicando la formazione di omegasomi (Figura 3A). Il knockdown di STX6 ha diminuito l'intensità del segnale GFP-ATG13 (P = 0,023, come determinato dall'ANOVA a due vie in EZR19). Sebbene il knockdown di STX6 non abbia influenzato in modo significativo l'intensità del segnale GFP-ATG13 nelle condizioni trattate con il veicolo, ha diminuito significativamente il segnale nelle condizioni trattate con Baf (Figura 3B). Collettivamente, questi risultati indicano che il knockdown di STX6 aumenta il rilascio di vescicole LC3-II positive legate all'accumulo di vescicole associate all'autofagosoma.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67385/67385fig01.jpg"> 
Figura 1: Risultati dell'immunoblotting delle cellule, delle frazioni P1 e P2 delle cellule HeLa trasfettate con siRNA di controllo o STX6 in trattamento con veicolo o Baf. Le cellule HeLa sono state trattate con veicolo (DMSO) o Baf da 100 nM per 24 ore dopo la trasfezione con siRNA di controllo o STX6 . Sono state isolate le frazioni di celle, P1 (20.000 × g di pellet) e P2 (110.000 × g di pellet). (A) Immagini rappresentative di immunoblotting di ciascuna frazione che mostrano STX6, TSG101, LC3 e PCNA. (B-D) L'analisi densitometrica per (B) STX6, (C) TSG101 e (D) LC3-II è stata eseguita dalle immagini immunoblot. L'intensità del segnale è stata normalizzata per le cellule di controllo o trasfettate con siRNA STX6 trattate con veicolo o Baf. I grafici a barre rappresentano i valori medi ± S.E.M. (N = 3). * indica P &lt; 0,05 con un test t spaiato a due code in Excel. Abbreviazioni: STX6 = sintattica 6; Baf = bafilomicina A1; DMSO = dimetilsolfossido; TSG101 = gene 101 della suscettibilità al tumore; LC3 = proteine associate ai microtubuli 1A/1B catena leggera 3B; PCNA = antigene nucleare delle cellule proliferanti; S.E.M. = errore standard della media. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67385/67385fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67385/67385fig02.jpg"> 
Figura 2: Analisi dell'immagine confocale di cellule HeLa che co-esprimono Lamp1-GFP e mCherry-LC3 trasfettate con siRNA di controllo o STX6 in condizioni trattate con veicolo e Baf. (A) Le immagini confocali di cellule HeLa che esprimono stabilmente LAMP1-GFP e mCherry-LC3 sono state trasfettate con siRNA di controllo o STX6 per 48 ore, seguite dall'esposizione a DMSO o 400 nM Baf per 4 ore. Barra della scala = 20 μm. (B,C) La dennatificazione degli autofagosomi (B) (punti negativi LAMP1-GFP e mCherry-LC3 positivi) e degli autolisosomi (C) (punti doppi positivi LAMP1-GFP e mCherry-LC3) è stata eseguita utilizzando il software Fiji. I dati nei grafici a barre sono presentati come valori medi ± S.E.M. (N = 3). * indica P &lt; 0,05, in base a un test t non accoppiato a due code in Excel. Abbreviazioni: Lamp1 = proteina di membrana 1 associata al lisosomia; LC3 = proteine associate ai microtubuli 1A/1B catena leggera 3B; STX6 = sintattica 6; Baf = bafilomicina A1; GFP = proteina fluorescente verde; S.E.M. = errore standard della media. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67385/67385fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67385/67385fig03.jpg"> 
Figura 3: Imaging confocale di cellule HeLa che esprimono GFP-ATG13, trasfettate con siRNA di controllo o STX6 e sottoposte a trattamento con veicolo o Baf. (A) Le cellule HeLa sono state trasfettate con siRNA di controllo o STX6 , seguite da trasfezione pEGFP-C1-hAtg13 e trattate con DMSO o 400 nM Baf per 4 ore. Barra della scala = 20 μm. (B) Le intensità relative del segnale sono state determinate normalizzando il segnale in ciascuna condizione a quello delle cellule di controllo trasfettate con siRNA trattate con Baf. Il grafico a barre mostra i dati come medie ± S.E.M. (N = 3). * indica P &lt; 0,05 con il test t spaiato a due code in Excel. Abbreviazioni: hAtg13 = gene 13 correlato all'autofagia umana; STX6 = sintattica 6; Baf = bafilomicina A1; DMSO = dimetilsolfossido; S.E.M. = errore standard della media. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67385/67385fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Figura S1 supplementare: Analisi immunoblot delle cellule, delle frazioni P1 e P2 delle cellule HeLa trasfettate con siRNA di controllo e trattate con Baf. Le cellule HeLa sono state trasfettate con siRNA di controllo ed esposte a 100 nM Baf per 24 ore. Sono state quindi preparate le frazioni: cellula, P1 (20.000 × g di pellet) e P2 (110.000 × g di pellet). Immagini immunoblot rappresentative di ULK1 e PCNA, che mostrano i loro livelli in ciascuna frazione per il confronto. Abbreviazioni: Baf = bafilomicina A1; ULK1 = unc-51 come la chinasi 1 attivante l'autofagia; PCNA = antigene nucleare delle cellule proliferanti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67385/67385_Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

Valutazione del rilascio di LC3-II attraverso vescicole extracellulari in relazione all'accumulo di vescicole intracellulari LC3-positive

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Valutare il flusso autofagico misurando LC3, p62 e LAMP1 Co-localizzazione usando la citometria del flusso di imaging multispettrale

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Valutazione del rilascio di LC3-II attraverso vescicole extracellulari in relazione allaccumulo di vescicole intracellulari LC3-positive (Video) | JoVE Journal

Valutazione del rilascio di LC3-II attraverso vescicole extracellulari in relazione all'accumulo di vescicole intracellulari LC3-positive

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