Name: Marcatura terminale fluorescente e incapsulamento di RNA lunghi per microscopia FRET-TIRF a singola molecola (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-18T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Impara la marcatura terminale fluorescente e l'incapsulamento di RNA lunghi per microscopia FRET-TIRF a singola molecola. Questo protocollo consente di studiare la dinamica e il ripiegamento degli RNA catalitici in tempo reale.

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<meta charset="utf8"></head><body>Marcatura terminale a doppio colore e incapsulamento vescicolare di RNA per studi smFRET-TIRF

<ol><li>Eitan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET-based+dynamic+structural+biology%3A+Challenges%2C+perspectives+and+an+appeal+for+open-science+practices%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">FRET-based dynamic structural biology: Challenges, perspectives and an appeal for open-science practices.</a> Elife. 10, e60416(2021).</li>
<li>Taekjip, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+resonance+energy+transfer+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Fluorescence resonance energy transfer at the single-molecule level.</a> Nat Rev Methods Primers. 4, 22(2024).</li>
<li>Ahunbay, E., Steffen, F. D., Zelger-Paulus, S., Sigel, R. K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+dual+end-labeling+of+large+ribozymes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical dual end-labeling of large ribozymes.</a> Methods Mol Biol. 2439, 191-204 (2022).</li>
<li>Ahunbay, E., Zelger-Paulus, S., Sigel, R. K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Group+II+Introns%3A+Highly+structured+yet+dynamic%5BTitle%5D)+AND+%22Chimia+%28Aarau%29%22%5BJournal%5D)">Group II Introns: Highly structured yet dynamic.</a> Chimia (Aarau). 77 (4), 235-241 (2023).</li>
<li>Steiner, M., Karunatilaka, K. S., Sigel, R. K. O., Rueda, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+studies+of+group+II+intron+ribozymes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Single-molecule studies of group II intron ribozymes.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105 (37), 13853-13858 (2008).</li>
<li>Karunatilaka, K. S., Solem, A., Pyle, A. M., Rueda, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+Mss116-mediated+group+II+intron+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of Mss116-mediated group II intron folding.</a> Nature. 467 (7318), 935-939 (2010).</li>
<li>Paudel, B. P., Fiorini, E., Börner, R., Sigel, R. K. O., Rueda, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+molecular+crowding+accelerates+group+II+intron+folding+and+maximizes+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Optimal molecular crowding accelerates group II intron folding and maximizes catalysis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 115 (47), 11917-11922 (2018).</li>
<li>Saha, R., Verbanic, S., Chen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+vesicles+chaperone+an+encapsulated+RNA+aptamer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Lipid vesicles chaperone an encapsulated RNA aptamer.</a> Nat Commun. 9 (1), 2313(2018).</li>
<li>Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+in+surface-tethered+lipid+vesicles+as+a+new+tool+for+single+biomolecule+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Immobilization in surface-tethered lipid vesicles as a new tool for single biomolecule spectroscopy.</a> J Phys Chem B. 105 (48), 12165-12170 (2001).</li>
<li>Cisse, I., Okumus, B., Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fueling+protein+DNA+interactions+inside+porous+nanocontainers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Fueling protein DNA interactions inside porous nanocontainers.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104 (31), 12646-12650 (2007).</li>
<li>Zelger-Paulus, S., Hadzic, M. C. A. S., Sigel, R. K. O., Börner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+of+fluorescently+labeled+RNAs+into+surface-tethered+vesicles+for+single-molecule+FRET+studies+in+TIRF+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Encapsulation of fluorescently labeled RNAs into surface-tethered vesicles for single-molecule FRET studies in TIRF microscopy.</a> Methods Mol Biol. 2331, 1-16 (2020).</li>
<li>Okumus, B., Wilson, T. J., Lilley, D. M. J., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+encapsulation+studies+reveal+that+single+molecule+ribozyme+heterogeneities+are+intrinsic%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Vesicle encapsulation studies reveal that single molecule ribozyme heterogeneities are intrinsic.</a> Biophys J. 87 (4), 2798-2806 (2004).</li>
<li>Ishitsuka, Y., Okumus, B., Arslan, S., Chen, K. H., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-independent+porous+nanocontainers+for+single-molecule+fluorescence+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Temperature-independent porous nanocontainers for single-molecule fluorescence studies.</a> Anal Chem. 82 (23), 9694-9701 (2010).</li>
<li>Liu, B., Mazouchi, A., Gradinaru, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trapping+single+molecules+in+liposomes%3A+surface+interactions+and+freeze-thaw+effects%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Trapping single molecules in liposomes: surface interactions and freeze-thaw effects.</a> J Phys Chem B. 114 (46), 15191-15198 (2010).</li>
<li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> J Vis Exp. (86), e50549(2014).</li>
<li>Paul, T., Myong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+generation+and+regeneration+of+PEG-passivated+slides+for+single-molecule+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for generation and regeneration of PEG-passivated slides for single-molecule measurements.</a> STAR Protoc. 3 (1), 101152(2022).</li>
<li>Hadzic, M. C. A. S., Kowerko, D., Börner, R., Zelger-Paulus, S., Sigel, R. K. O. Detailed analysis of complex single molecule FRET data with the software MASH. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHadzic%2C+MCAS+%22Imaging%2C+Manipulation%2C+and+Analysis+of+Biomolecules%2C+Cells%2C+and+Tissues+IX%22">Imaging, Manipulation, and Analysis of Biomolecules, Cells, and Tissues IX</a>. Farkas, D. L., Nicolau, D. V., Leif, R. C. SPIE 971119, (2016).</li>
<li>Chu, B. C., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Le+Orgel.+Derivatization+of+unprotected+polynucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Le Orgel. Derivatization of unprotected polynucleotides.</a> Nucleic Acids Res. 11 (18), 6513-6529 (1983).</li>
<li>Qin, P. Z., Pyle, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+labeling+of+RNA+with+fluorophores+and+other+structural+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Site-specific labeling of RNA with fluorophores and other structural probes.</a> Methods. 18 (1), 60-70 (1999).</li>
<li>Whitfeld, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+determination+of+nucleotide+sequence+in+polyribonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">A method for the determination of nucleotide sequence in polyribonucleotides.</a> Biochem J. 58 (3), 390-396 (1954).</li>
<li>Zamecnik, P. C., Stephenson, M. L., Scott, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+purification+of+soluble+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Partial purification of soluble RNA.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 46 (6), 811-822 (1960).</li>
<li>Proudnikov, D., Mirzabekov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+methods+of+DNA+and+RNA+fluorescent+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Chemical methods of DNA and RNA fluorescent labeling.</a> Nucleic Acids Res. 24 (22), 4535-4542 (1996).</li>
<li>Wang, P. Y., Sexton, A. N., Culligan, W. J., Simon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbodiimide+reagents+for+the+chemical+probing+of+RNA+structure+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Carbodiimide reagents for the chemical probing of RNA structure in cells.</a> RNA. 25 (1), 135-146 (2019).</li>
<li>Mitchell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+RNA+structural+probing+of+uracil+and+guanine+base-pairing+by+1-ethyl-3-%283-dimethylaminopropyl%29carbodiimide+%28EDC%29%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">In vivo RNA structural probing of uracil and guanine base-pairing by 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC).</a> RNA. 25 (1), 147-157 (2019).</li>
<li>Rinaldi, A. J., Suddala, K. C., Walter, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+purification+and+labeling+of+RNA+for+single+molecule+fluorescence+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Native purification and labeling of RNA for single molecule fluorescence studies.</a> Methods Mol Biol. 1240, 63-95 (2015).</li>
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<li>Fiorini, E., Börner, R., Sigel, R. K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mimicking+the+in+vivo+Environment--The+Effect+of+Crowding+on+RNA+and+Biomacromolecular+Folding+and+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Chimia%22%5BJournal%5D)">Mimicking the in vivo Environment--The Effect of Crowding on RNA and Biomacromolecular Folding and Activity.</a> Chimia. 69 (4), 207-212 (2015).</li>
<li>Peng, H., Lelievre, A., Landenfeld, K., Müller, S., Chen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+encapsulation+stabilizes+intermolecular+association+and+structure+formation+of+functional+RNA+and+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Vesicle encapsulation stabilizes intermolecular association and structure formation of functional RNA and DNA.</a> Curr Biol. 32 (1), 86-96.e6 (2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td><forte>Etichettatura dell'RNA</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5&nbsp; mL di DNA LoBind provette&nbsp;</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td></td><td></td>30108035</tr><tr><td>1-etil-3-(3-dimetilamminopropil)carbodiimmide cloridrato (EDC-HCl o EDC)</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>11844071 perforare EDC, formato senza pesare. Negozio a&nbsp; -20 &deg; Acido C</td></tr><tr><td>3-morfolino-1-solfonico (MOPS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69947</td><td>BioUltra, per biologia molecolare, &ge; 99,5% (titolazione)</td></tr><tr><td>Acido acetico (glaciale)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00063</td><td>100%, anidro per analisi EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>Unità di filtrazione centrifuga&nbsp;</td><td>Sartorius</td><td>VS0132</td><td>Vivaspin 500, MWCO 50.000, PES, 500 &mu; L</td></tr>. <tr><td>Cianina5 idrazide (Cy5-idrazide)</td><td>Lumiprobe</td><td>23070</td><td>5 mg, numero CAS 1427705-31-4&nbsp;</td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido (DMSO)</td><td>New England Biolabs</td><td>12611P</td><td>Etanolo VWR di grado di biologia molecolare</td></tr><tr><td></td> Prodotti <td>chimici</td><td>20821.296P</td><td>Assoluto &ge; 99,8%</td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>per la biologia molecolare, &ge; 99,0%</td></tr><tr><td>Acido cloridrico (HCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00317</td><td>fumante 37%, per analisi EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>N-idrossisuccinimide (NHS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>130672</td><td>98%</td></tr><tr><td>Acetato di sodio (NaOAc)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8750</td><td>anidro, ReagentPlus, &ge; 99,0%</td></tr><tr><td>Meta-periodato di sodio (NaIO4)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Life Technologies</td><td>20504</td><td>Linea di prodotti Pierce</td></tr><tr><td>Sulfo-cianine3 ammina (sCy3-ammina)</td><td>Lumiprobe</td><td>213C0</td><td>5 mg, numero CAS 2183440-43-7</td></tr><tr><td>Tris(idrossimetil)amminometano (Tris)</td><td>Biosolve</td><td>200923</td> Preparazione della camera <td>di grado <</td></tr>forte> di biologia molecolare<tr><td></ forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-amminopropil)trietossisilano (APTES)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440140</td><td>99%</td></tr> <tr><td>Acetone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00014</td><td>per analisi EMSURE ACS, ISO, Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>Biotina-Polietilenglicole-Succinimidil valerato (biotina-PEG-SVA, bPEG) e Metossi polietilenglicole-Succinimidil valerato (mPEG-SVA)</td><td>Laysan Bio, Inc.</td><td></td><td>BIO-PEG-SVA, MW 5.000 e MPEG-SVA, MW 5.000 - Kit combinato</td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti</td><td>Carl Roth</td><td>H876.2</td><td>24 x 24 mm, 0,13-0,16&nbsp; mm di spessore</td></tr><tr><td>Deconex 11 universale</td><td>Borer Chemie AG</td><td>17416492</td><td>Soluzione per la pulizia della vetreria da laboratorio</td></tr><tr><td>Punta per carotaggio rivestita di diamante</td><td>Crystalite corporation</td><td></td><td>1 mm di spessore</td></tr><tr><td>Perforatore diamantato</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>VWR Chemicals</td><td>20821.296P</td><td>Assoluto &ge; 99,8%</td></tr><tr><td>Barattolo di colorazione Coplin in vetro con coperchio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Distanziatore per immagini</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>654008</td><td>SecureSeal, 8 pozzetti,&nbsp; 9&nbsp; mm &volte; 0,12&nbsp; mm</td></tr><tr><td>Pulitore al plasma di ossigeno</td><td>Zepto One</td><td></td><td>Diener</td></tr><tr><td>Idrossido di potassio (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>per la biologia molecolare, &ge; 99.0%</td></tr><tr><td>Vetrini in quarzo</td><td>G. Finkenbeiner, Inc.</td><td></td><td>7,5&nbsp; x&nbsp; 2,5&nbsp; cm, spessore 1 mm</td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio (NaHCO3)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td>BioXtra, 99,5-100,5%</td></tr> <tr><td><forte>Preparazione della torta lipidica</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>16:0 Biotinyl Cap PE, bPE (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-(cap biotinyl) (sale sodico), C53H98N4O11PNaS)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>870277P</td><td>Stabile per 1 anno a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>14:0 PC, DMPC (1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-fosfocholine o 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina, C36H72NO8P)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850345P</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga da 2,0 mL, autoclave Safe-Lock</td><td>Eppendorf</td><td>0030120094</td><td>per sterilizzare</td></tr><tr><td>500&nbsp; mL Pallone</td><td></td><td></td><td></td>di Schlenk</tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Merck</td><td>1.02445</td><td>per analisi EMSURE ACS, ISO, Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immobilizzazione superficiale tramite incapsulamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(&plusmn;)Acido -6-idrossi-2,5,7,8-tetrametilcromatono-2-carbossilico (Trolox&reg;)</td><td>Thermo Fischer</td><td>53188-07-1</td><td>Acido 97%</td></tr><tr><td>3-morfolino-propano-1-solfonico (MOPS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69947</td><td>BioUltra, per biologia molecolare, &ge; 99,5% (titolazione). Conservare a +4 gradi C nel buio.</td></tr><tr><td>Linguette di tenuta adesive</td><td>Grace Bio-Labs&nbsp;</td><td>629200</td><td></td></tr><tr><td>Catalasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9001-05-2, C30</td><td>da fegato bovino, sospensione acquosa, 10.000-40.000 unità/mg di</td></tr><tr><td>proteina D-glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td>&ge; 99,5% (GC), BioXtra</td></tr><tr><td>Extruder membrana in policarbonato (PC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610005-1EA</td><td>0,1 &mu; m, 19 mm</td></tr><tr><td>Set di estrusori con blocco riscaldante</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio ossidasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9001-37-0</td><td>da Aspergillus niger, Tipo VII,&nbsp; polvere liofilizzata, &ge; 100.000 unità/g solido (senza aggiunta di ossigeno)</td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7786-30-3, M1028</td><td>per biologia molecolare, soluzione 1,00 M &plusmn; 0,01 M</td></tr><tr><td>Disco di drenaggio in poliestere (PE), membrana</td><td>Whatman, Cytiva</td><td>230300</td><td>10 mm</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60128</td><td>BioUltra, per biologia molecolare, &ge; 99,5% (AT)</td></tr><tr><td>Idrossido di potassio (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>per biologia molecolare, &ge; 99,0%</td></tr><tr><td>Streptavidina</td><td>Thermo Fischer</td><td>434301</td><td></td></tr></tbody></table>

marcatura terminale fluorescente e incapsulamento di rna lunghi per microscopia fret-tirf a singola molecola

Fluorescent End-Labeling and Encapsulation of Long RNAs for Single-Molecule FRET-TIRF Microscopy

Presentiamo la marcatura sito-specifica a singola e doppia fluorescenza dell'RNA 915-nt di interesse, l'introne mitocondriale di lievito Sc.ai5γ gruppo II, affiancato da sequenze esoniche. La coppia di fluorofori FRET è posizionata alle estremità dell'RNA tramite l'attivazione EDC/NHS del 5'-fosfato e l'ossidazione periodica del 3'-ribosio, seguita dai rispettivi attacchi coloranti. Abbiamo quindi verificato i coniugati RNA-colorante mediante elettroforesi su gel fluorescente, come presentato nella Figura 4A. La co-migrazione dell'RNA e dei fluorofori sul gel di agarosio conferma il successo dell'etichettatura. Successivamente, come mostrato nella Figura 4B, è stata utilizzata la spettroscopia di fluorescenza d'insieme per caratterizzare l'introne del gruppo II a doppia marcatura. Il trasferimento di energia, cioè FRET, è stato osservato dopo l'eccitazione del colorante donatore dimostrando la doppia marcatura dell'RNA. In particolare, coerentemente con la natura dipendente dalla distanza di FRET, il ripiegamento dell'RNA intronico del gruppo II in presenza di ioni metallici ha portato ad un aumento dell'efficienza di FRET, come evidenziato dalla diminuzione dell'emissione del donatore (freccia verde) e da un corrispondente aumento dell'emissione dell'accettore (freccia rossa). Ciò indica che questa marcatura FRET tiene traccia dei cambiamenti conformazionali del ribozima.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67391/67391fig04.jpg"> 
Figura 4: Caratterizzazione dei coniugati RNA-colorante. (A) L'analisi analitica basata su gel di RNA marcato a fluorescenza singola e doppia mostra la co-migrazione dei coloranti con l'RNA su un gel di agarosio al 2%. La co-localizzazione dei fluorofori nel campione a doppia marcatura è indicata dalla banda gialla nell'immagine unita (in basso) dei canali Cy3 (in alto, verde) e Cy5 (in centro, in rosso), visualizzati rispettivamente con un'illuminazione di 532 nm e 635 nm. Corsia 1: 5'-sCy3 solo RNA marcato, corsia 2: 3'-Cy5 solo RNA marcato e corsia 3: RNA marcato a doppia estremità (5'-sCy3 e 3'-Cy5). (B) La spettroscopia di fluorescenza d'insieme conferma la doppia marcatura. Il trasferimento di energia all'eccitazione del donatore (λex = 515 nm, λem = 670 nm) verifica che entrambi i coloranti siano accoppiati con successo all'RNA. La curva grigia rappresenta il profilo di emissione dell'RNA pre-catalitico, mentre la curva nera dimostra un aumento dell'efficienza FRET nell'RNA intronico del gruppo II ripiegato (incubato con 500 mM di KCl a 70 °C per 3 minuti, raffreddato a 42 °C per 5 minuti, seguito dall'aggiunta di 100 mM di MgCl2). Questa figura è stata adattata da Ahunbay et al.3 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67391/67391fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Con in mano l'introne del gruppo II wild-type marcato in modo fluorescente, siamo ora in grado di esplorare le sue dinamiche a livello di singola molecola. Una volta incapsulato in vescicole fosfolipidiche, l'RNA marcato viene immobilizzato su una superficie di microscopia a densità superficiali molto basse per ottenere la risoluzione di una singola molecola per smFRET-TIRF. Come si vede nella Figura 5A, diverse singole molecole possono essere tracciate contemporaneamente. La microscopia TIRF consente il monitoraggio in tempo reale dell'efficienza FRET e delle sue variazioni nel tempo. La Figura 5B esemplifica le tracce FRET statiche e dinamiche a singola molecola dell'RNA marcato e incapsulato. Una tipica traccia dinamica mostra un'anticorrelazione tra i segnali del donatore e dell'accettore che fluttuano l'efficienza del FRET. Quando l'emissione dell'accettore all'aumento dell'eccitazione del donatore, l'emissione del donatore diminuisce di conseguenza, indicando un cambiamento dinamico nella distanza tra i coloranti. Questa anticorrelazione suggerisce cambiamenti conformazionali nella molecola di RNA.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67391/67391fig05.jpg"> 
Figura 5: Comportamento altamente dinamico dell'RNA intronico del gruppo II rivelato da smFRET. L'RNA dell'introne del gruppo II marcato a doppia estremità viene incapsulato in una vescicola fosfolipidica e immobilizzato sulla superficie per l'imaging con un microscopio TIRF basato su obiettivo. (A) Immagine unita di singole molecole di RNA marcate che esibiscono emissione donatrice (sCy3, verde) ed emissione accettore (Cy5, rosso) dopo eccitazione a 532 nm. (B) Le traiettorie tipiche di smFRET di (a sinistra) di una molecola di RNA statica in cui le intensità del donatore e dell'accettore non fluttuano nel tempo e (a destra) di una molecola di RNA dinamica, in cui le intensità del donatore e dell'accettore sono anticorrelate, con le efficienze FRET in giallo. Le singole molecole vengono localizzate e analizzate utilizzando MASH-FRET17. Vengono applicati l'eccitazione diretta, il sanguinamento e le correzioni dei fattori γ. Abbreviazioni: smFRET = trasferimento di energia di risonanza di Förster a molecola singola. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67391/67391fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Marcatura terminale fluorescente e incapsulamento di RNA lunghi per microscopia FRET-TIRF a singola molecola

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) excels in studying dynamic biomolecules by allowing precise observation of their ...

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