Marcatura terminale fluorescente e incapsulamento di RNA lunghi per microscopia FRET-TIRF a singola molecola

La nostra ricerca si concentra sulla dinamica degli RNA attivi catalitici e su come queste dinamiche cambiano in diverse condizioni ambientali. Utilizziamo FRET a singola molecola per studiare l'influenza di fattori come le linee mediane monovalenti e bivalenti, le proteine chaperone e gli agenti di affollamento sulla dinamica dell'RNA. Incorporare con precisione i fluorofori donatori e accettori senza interrompere la struttura e la funzione dell'RNA è una sfida.

Inoltre, tracciare il ripiegamento di un grande RNA dinamico è difficile. Tuttavia, il protocollo di marcatura e incapsulamento stabilito ci consente di monitorare le dinamiche di ripiegamento dell'RNA funzionale nel tempo. Il nostro protocollo affronta la sfida di osservare RNA di grandi dimensioni e cataliticamente attivi in tempo reale e in condizioni neofisiologiche.

Marcando e incapsulando covalentemente l'RNA e le vescicole, che vengono poi immobilizzate in superficie, possiamo monitorare la funzione dell'RNA con TIRF a singola molecola. Ci concentriamo sulla marcatura covalente di FRET di RNA catalitici lunghi e in particolare di introni del gruppo II. Si tratta di una sfida a causa della loro complessità strutturale.

Quando incapsulato in vescicole, possiamo mantenere l'RNA all'interno del campo evanescente per la microscopia TIRF, eppure l'RNA può fluttuare liberamente. In questo modo, smFRET può rivelare il comportamento dinamico dell'RNA senza ostacoli. Continueremo a cercare di capire come funziona realmente la natura, concentrandoci sulla relazione struttura-funzione e sulla dinamica di ribosomi, riboswitch e altri RNA regolatori utilizzando un approccio multi-tecnica.

Pertanto, il passaggio a indagini in condizioni fisiologiche e cellulari sarà una delle principali enfasi del nostro lavoro in futuro. Per iniziare, aliquotare l'RNA di interesse, avendo da 50 a 75 microgrammi di RNA per provetta in 55 microlitri di acqua a doppia distillazione, quindi aggiungere 45 microlitri della miscela di acetato di sodio EDC/NHS pH 6 all'RNA. Incubare la miscela per quattro ore a 25 gradi Celsius agitando a 500 giri/min.

Dopo l'incubazione, risospendere il pellet di RNA attivato in 95 microlitri di tampone MOPS da 100 millimolari pH 7,5. Quindi aggiungere cinque microlitri di cianine-3 ammina solfonata da due millimolari all'RNA attivato e incubare a 25 gradi Celsius per 16 ore a 500 giri/min per accoppiare il fluoroforo al fosfato 5-prime attivato. Il giorno successivo, aggiungere 200 microlitri di acqua bidistillata per migliorare la separazione.

Quindi purificare l'RNA marcato con 5-primo fosfato mediante precipitazione con etanolo. Dopo la purificazione, risospendere l'RNA marcato in 100 microlitri di tris HCl da 100 millimolari e incubare per due ore a 25 gradi Celsius. Quindi, per rimuovere i coloranti liberi, lavare l'RNA marcato in acqua bidistillata con filtrazione centrifuga.

Per la marcatura a doppia estremità, aliquotare l'RNA marcato con 5 estremità prime, avente circa 50-75 microgrammi di RNA per provetta in 90 microlitri di soluzione. Aggiungere cinque microlitri di tampone acetato di sodio monomolare pH 5,5. Quindi aggiungere quattro microlitri di soluzione madre di metaperiodato di sodio da 500 millimolari appena preparata.

Per l'etichettatura singola a 3 prime, aggiungere otto microlitri di soluzione madre metaperiodata. Dopo aver incubato le soluzioni al buio per due ore, pipettare 30 microlitri di glicerolo al 50% per fermare la reazione. Dopo 30 minuti di incubazione, aggiungere 400 microlitri di miscela di precipitazione di etanolo e acetato di sodio ghiacciato.

Risospendere il pellet di RNA ossidato in 95 microlitri di tampone acetato di sodio da 50 millimolari pH sei. Purificare l'RNA marcato a doppia estremità mediante precipitazione di etanolo e filtrazione centrifuga, come dimostrato in precedenza. Eluire l'RNA purificato in acqua a doppia distillazione.

Confrontare visivamente i colori del surnatante e del pellet ottenuti dopo ogni passaggio. Calcola le concentrazioni di RNA e colorante coniugato su uno spettrofotometro UV-visibile. L'elettroforesi su gel fluorescente ha confermato il successo della marcatura singola e doppia dell'RNA, come dimostrato dalla comigrazione dell'RNA con i fluorofori.

L'efficienza FRET è aumentata in presenza di ioni metallici, indicando il ripiegamento dell'RNA, che ha portato a una diminuzione dell'emissione del donatore e a un aumento dell'emissione dell'accettore. Per preparare una camera microfluidica, utilizzare un trapano diamantato per praticare quattro fori nelle slitte di quarzo per formare due canali. Posizionare i vetrini di quarzo forati e circa il doppio dei vetrini coprioggetti in un barattolo di vetro Coplin con coperchio.

Sonicare i vetrini e i vetrini coprioggetti in acqua a doppia distillazione per cinque minuti. Quindi, sonicare il barattolo in una soluzione detergente per vetreria da laboratorio al 10% per 30 minuti a 50 gradi Celsius. Dopo aver risciacquato il barattolo con acqua distillata doppia, sonicare in una soluzione di idrossido di potassio monomolare per 30 minuti e lasciarlo nella soluzione per una notte.

Dopo ripetuti risciacqui e sonicazione con acqua distillata, asciugare i vetrini e i vetrini coprioggetti utilizzando il flusso di azoto gassoso. Trattare i vetrini e i vetrini coprioggetti secchi con un detergente al plasma di ossigeno per 30 minuti. Mettere i vetrini e i vetrini coprioggetti puliti in un barattolo colorante Coplin contenente la soluzione di etanolo al 3% di test AP Sonicate per un minuto e poi incubare per 30 minuti.

Sciacquare i vetrini e i vetrini coprioggetti tre volte ciascuno con etanolo assoluto e acqua bidistillata, quindi asciugarli sotto il flusso di azoto gassoso. Quindi, prepara una scatola umida riempiendo a metà una scatola vuota di puntali per pipetta con acqua bidistillata. Posizionare i vetrini all'interno della scatola con il lato da trattare rivolto verso l'alto.

Aggiungere 30 microlitri di miscela bPEG/mPEG appena preparata al centro del vetrino per coprire entrambi i canali. Coprire la goccia con un vetrino coprioggetti pulito e chiudere la scatola umida. Incubare la scatola per una notte al buio per la PEGilazione.

Il giorno successivo, sciacquare i vetrini e i vetrini coprioggetti passivati con PEG e biotinilati con acqua bidistillata e osservare la variazione dell'idrofobicità delle superfici trattate. Attacca l'adesivo biadesivo alla diapositiva, assicurandoti che copra l'area di interesse. Quindi posizionare con cura il vetrino coprioggetti sulla parte superiore del vetrino, allineando le superfici PEGilate l'una di fronte all'altra.

Trasferire la camera assemblata in una provetta da centrifuga da 50 millilitri e riempire la provetta con azoto gassoso. Per iniziare, usa un ago sterile per praticare un foro dall'interno verso l'esterno nel coperchio di una provetta sterile pulita da due millilitri. Aggiungere 109 microlitri di miscela bPE-DMPC nel tubo.

Posiziona un inserto divisorio di celle di cartone da una scatola di conservazione per microprovette in un pallone Schlenk da 500 millilitri che funge da supporto per provette. Utilizzando una pinzetta lunga, posizionare con cura i tubi contenenti la miscela lipidica nel supporto del tubo. Far evaporare il cloroformio sotto un basso flusso di azoto gassoso durante la notte.

Dopo aver ottenuto lo strato lipidico essiccato, sigillare i tubi con parafilm per coprire i fori. Assemblare l'estrusore utilizzando una membrana in policarbonato da 100 nanometri e un disco di drenaggio in poliestere da 10 millimetri. Equilibrare la siringa e le membrane con un tampone anti-ammiccamento.

Dopo aver mescolato l'RNA marcato a doppia estremità con il tampone anti-lampeggiamento, idratare la torta lipidica con la miscela di tampone anti-lampeggiamento dell'RNA a 30 gradi Celsius. Agitare per cinque minuti a 1.400 giri/min, seguiti da 15 minuti a 700 giri/min. Centrifugare la miscela per due minuti a 13.000 g e diluire il surnatante con 250 microlitri di tampone anti-ammiccamento.

Riempire la siringa con la sospensione lipidica di RNA ed estrudere 35 volte a 30 gradi Celsius su un blocco riscaldante per incapsulare l'RNA marcato a doppia estremità in vescicole fosfolipidiche di 100 nanometri di diametro. Lavare la camera due volte con 200 microlitri di tampone standard 5X a temperatura ambiente. Riempire la camera con 50 microlitri di soluzione di streptavidina da 20 microlitri per millilitro e incubare per cinque minuti.

Quindi lavare la camera con 200 microlitri di tampone standard e 100 microlitri di tampone anti-lampeggiamento. Aggiungere 75 microlitri di sospensione vescicola e incubare per 10 minuti per l'immobilizzazione dell'RNA incapsulato sulla superficie. Dopo l'immobilizzazione, lavare la camera con 200 microlitri di tampone di imaging appena preparato.

Per l'acquisizione dei dati, montare la camera sul microscopio TIRF e acquisire i dati smFRET con eccitazione laser alternata. L'imaging FRET a singola molecola mediante microscopia TIRF ha tracciato le singole molecole di RNA e ha rilevato cambiamenti in tempo reale nell'efficienza FRET. Le tracce dinamiche di una singola molecola hanno mostrato fluttuazioni anti-correlate tra i segnali del donatore e dell'accettore, indicando cambiamenti di conferma nell'RNA.