Colorazione viva/morta per la quantificazione di cellule vitali ma non coltivabili nei batteri che causano ferite trattati con miele di Manuka

Questo progetto di ricerca mira a studiare l'impatto del miele di Manuka sulla fisiologia batterica. Studi recenti hanno fornito ulteriori informazioni sugli effetti antimicrobici del miele di Manuka sulla fisiologia batterica. I nostri risultati preliminari indicano che i batteri del miele di Manuka entrano nello stato di dormienza resistente agli antibiotici, vitale ma non coltivabile, ma in misura minore rispetto a quelli trattati con antibiotici convenzionali.

Sulla base dei nostri esperimenti, sarebbe interessante confrontare i profili di espressione del miele di Manuka e dei VBNC convenzionali indotti da antibiotici. Per iniziare, prendi le fiale contenenti ceppi batterici congelati. Apri ciascuno di essi in sequenza e usa uno stick sterile per raschiare una piccola quantità di batteri congelati sulla piastra di agar Luria-Bertani o LB opportunamente etichettata.

Riposizionare il tappo del flaconcino e riporlo rapidamente nel congelatore. Incubare le colture batteriche per 18-24 ore a 37 gradi Celsius. Il giorno seguente, utilizzare una pipetta sierologica per trasferire due millilitri di brodo LB in due provette sterili.

Sterilizzare l'ansa di inoculazione nella fiamma del bruciatore Bunsen. Quindi trasferire un quarto di ansa di batteri dalla piastra di agar LB alla provetta contenente brodo LB opportunamente etichettata. Incubare la provetta in condizioni aerobiche in un'incubatrice agitata a circa 250 giri/min a 37 gradi Celsius per 18-24 ore.

Per l'impostazione del miele di Manuka e i trattamenti antibiotici dei batteri, aggiungere 10 microlitri di coltura batterica a 10 millilitri di brodo Mueller Hinton per ottenere la diluizione 1:1.000 della coltura batterica, che ha circa 10-60 unità formanti colonie per millilitro. Utilizzare le colture diluite per preparare tre campioni per ogni specie batterica, un controllo non trattato, un campione trattato con miele di Manuka e un campione trattato con antibiotici. Aggiungere il miele di Manuka e l'antibiotico negli appositi tubi.

Trasferire 0,1 millilitri e 0,5 millilitri del campione non trattato in provette sterili per microcentrifuga per il conteggio vitale delle piastre e la colorazione viva/morta per il T equivale a zero campioni. Quindi incubare i campioni di controllo non trattati, trattati con miele di Manuka e trattati con antibiotici in condizioni aerobiche a 37 gradi Celsius in un incubatore agitatore a 250 giri/min per 24 ore. Preparare una diluizione seriale di dieci volte del campione T uguale a zero in brodo LB per ottenere un numero numerabile di cellule per la conta su piastra vitale.

Distribuire 50 microlitri di ciascun campione diluito su metà di una piastra di agar LB. Incubare le piastre di agar in condizioni aerobiche a 37 gradi Celsius per 24 ore. Il giorno seguente, rimuovere le piastre di agar LB dall'incubatrice.

Identificare la piastra di diluizione contenente circa 25-150 colonie e contare il numero esatto di colonie. Utilizzare la formula dell'unità formante colonia per determinare il numero di cellule coltivabili per millilitro. Il terzo giorno, aggiungere 0,5 millilitri di cloruro di sodio allo 0,85% a 0,5 millilitri di T equivale a zero campione di controllo con colorazione viva/morta non trattata.

Combinare 1,5 microlitri di SYTO 9 e 1,5 microlitri di ioduro di propidio per campione. Quindi aggiungere tre microlitri della miscela a ciascun campione. Incubare i campioni a 21 gradi Celsius al buio per 15 minuti.

Trasferire sei microlitri del campione colorato e delicatamente miscelato in un emocitometro monouso e visualizzarlo al microscopio a fluorescenza utilizzando un isotiocianato di fluoresceina o un filtro FITC e una lente dell'obiettivo 40X. Cattura un'immagine che mostri sia le linee della griglia dell'emocitometro che le celle verdi. Conta le celle verdi in sei campi per campione, annotando le dimensioni della griglia per calcolare il numero di celle verdi per volume.

Infine, calcolare il numero di cellule vitali ma non coltivabili sottraendo il numero di cellule coltivabili per millilitro ottenuto utilizzando il conteggio delle piastre vitali dal numero di cellule vitali per millilitro ottenuto utilizzando la colorazione viva/morta. Il quarto giorno, dopo aver rimosso dall'incubatrice le colture batteriche non trattate, trattate con miele di Manuka e trattate con antibiotici, raccogliere 0,1 millilitri e 0,5 millilitri di ciascun campione in provette da microcentrifuga per il conteggio vitale delle piastre e la colorazione viva/morta. Questa figura mostra il numero di cellule coltivabili e vitali determinato utilizzando il conteggio delle piastre vitali e la colorazione viva/morta per le colture di S.aureus e P.aeruginosa.

I risultati mostrano che il numero di cellule vitali e coltivabili rilevate nelle colture non trattate e trattate con miele di Manuka non era significativamente diverso. Le colture di S. aureus trattate con tobramicina avevano meno cellule coltivabili rispetto alle cellule vitali, ma questa differenza non era significativa. Solo P. aeruginosa trattata con meropenem ha mostrato una riduzione statisticamente significativa delle cellule coltivabili rispetto alle cellule vitali.