Ingegnerizzazione del recettore dell'antigene chimerico-cellule natural killer mirate alle infezioni fungine utilizzando il sistema di trasposone non virale della bella addormentata

La nostra ricerca si concentra sullo sviluppo di una terapia cellulare CAR pronta all'uso per le infezioni fungine invasive. Il nostro obiettivo è identificare i migliori bersagli, i disegni CAR e la combinazione di cellule immunitarie per ottenere risultati terapeutici ottimali. Gli sviluppi recenti, compreso il nostro lavoro, si sono concentrati sullo sviluppo di terapie con cellule T CAR mirate all'Aspergillus fumigatus.

Queste cellule ingegnerizzate hanno mostrato risultati promettenti in modelli preclinici riducendo significativamente il carico fungino, controllando l'immunità antifungina e migliorando la sopravvivenza globale. Attualmente la maggior parte della ricerca nel campo si concentra sulla produzione di cellule T CAR specifiche per un insieme molto limitato di bersagli utilizzando vettori virali o sistemi di trasposoni della bella addormentata. Le sfide principali riguardano l'identificazione di bersagli fungini ottimali e la produzione di un prodotto cellulare pronto all'uso che sia efficace e scalabile per le applicazioni cliniche.

Con questo protocollo, stiamo affrontando la necessità di metodi economici e scalabili per generare cellule CAR-NK non virali. Fornisce un approccio accessibile per lo screening di nuovi bersagli antifungini, fornendo un passo fondamentale verso la terapia cellulare CAR-NK pronta all'uso per le infezioni fungine. Per iniziare, controllare le cellule NK-92 al microscopio per verificare la presenza di cluster su uno sfondo chiaro, aggiungere 2 millilitri di terreno di coltura cellulare per pozzetto per ogni condizione in una piastra a sei pozzetti e posizionare la piastra in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.

Trasferire 8 volte 10 alla potenza di 6 celle NK-92 in una provetta a fondo conico da 15 millilitri e centrifugare la provetta a 200 G per cinque minuti con un'accelerazione e una decelerazione di 3. Dopo aver scartato il surnatante, riempire la provetta contenente il pellet di cella con un massimo di 15 millilitri di PBS preriscaldato e centrifugare nuovamente. Durante la centrifugazione, pipettare 8 microgrammi di DNA plasmidico Af-CAR e 4 microgrammi di minicerchio SB100X in una provetta di reazione e mantenere libero il DNA della seconda provetta per fungere da finto controllo.

Per il sistema di trasfezione, aggiungere 3 millilitri di tampone elettrolitico nella prima provetta e posizionarla nella stazione di pipetta. Dopo la centrifugazione, scartare delicatamente il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 200 microlitri di tampone di risospensione. Quindi aggiungere 100 microlitri di sospensione cellulare in ciascuna delle due provette di reazione e mescolare delicatamente.

Pipettare la miscela di cellule di DNA dalla prima provetta di reazione utilizzando la pipetta del sistema di trasfezione, inserire la pipetta di trasfezione verticalmente nella provetta nella stazione di pipetta. Impostare il primo impulso a 1.650 volt e il tempo dell'impulso a 20 millisecondi prima di premere start per avviare l'impulso. Dopo il primo impulso, impostare il secondo impulso a 500 volt e il tempo dell'impulso a 100 millisecondi e avviare il secondo impulso.

Una volta completato il secondo impulso, rimuovere lentamente la pipetta dalla stazione di pipetta. Trasferire immediatamente le cellule in un pozzetto della piastra di coltura preparata contenente 2 millilitri di terreno di coltura cellulare preriscaldato e muovere delicatamente la piastra con un movimento circolare per distribuire uniformemente le cellule. Incubare la piastra in un'incubatrice umidificata a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.

Dopo 30 minuti di incubazione, aggiungere l'interleuchina-2 ai pozzetti ad una concentrazione finale di 150 unità internazionali per millilitro. Per iniziare, trasfetta le cellule NK-92 con il plasmide desiderato. Trasferire le cellule in una provetta a fondo conico da 15 millilitri.

Quindi centrifugare le cellule e diluirle a una concentrazione da 1 a 2 volte 10 alla potenza di 6 cellule per 100 microlitri utilizzando il tampone. Aggiungere un microlitro di biotina anti EGFR-T per 1 volte 10 alla potenza di 6 cellule e mescolare delicatamente per garantire che la soluzione sia distribuita uniformemente. Incubare la provetta per 25 minuti a 4 gradi Celsius.

Dopo l'incubazione, riempire la provetta con un massimo di 10 millilitri di tampone. Quindi, centrifugare la provetta a 200 G per cinque minuti con accelerazione e decelerazione di 3 e scartare il surnatante dopo la centrifugazione. Quindi aggiungere 8 microlitri di tampone freddo seguiti da due microlitri di perle magnetiche anti-biotina per 1 volte 10 alla potenza di 6 cellule.

Incubare la provetta per 15 minuti a 4 gradi Celsius. Per lavare le cellule, riempire la provetta con un massimo di 10 millilitri di tampone e centrifugare. Dopo aver scartato il surnatante, risospendere le cellule in 500 microlitri di tampone.

Posizionare una colonna LS nel magnete max e lavarla con 3 millilitri di tampone. Aggiungere la sospensione della cella una volta che il buffer è stato completamente migrato attraverso la colonna. Dopo aver lavato la colonna, rimuoverla dal magnete e posizionarla in un tubo a fondo conico pulito da 15 millilitri.

Aggiungere 5 millilitri di tampone alla colonna e utilizzare lo stantuffo per eliminare le celle positive all'EGF-R il più rapidamente possibile. L'efficienza di trasfezione dopo il recupero ha raggiunto il 10-20% e l'arricchimento massimo ha aumentato la purezza delle cellule Af-CAR-NK-92 a oltre il 95%Per iniziare, ottenere cellule NK-92 arricchite che esprimono transgeni utilizzando la tecnica di selezione cellulare attivata magneticamente. Quindi preparare una sospensione di conidi Aspergillus fumigatus a una concentrazione di 2,5 volte 10 alla potenza di 5 conidi per millilitro nel mezzo.

Erogare 100 microlitri di sospensione di conidi in ciascun pozzetto di una piastra di coltura a 96 pozzetti e incubare la piastra a 25 gradi Celsius per 16 ore. Il secondo giorno, lavare due volte le cellule NK-92 finte e trasfettate con plasmide con il terreno e aggiungere 5 volte 10 alla potenza di 4 cellule NK-92 in 100 microlitri di terreno per pozzetto della piastra contenente il fungo da co-coltivare. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius in un incubatore ad anidride carbonica umidificato per almeno 6 ore.

Dopo aver centrifugato la piastra a 300 G per cinque minuti, raccogliere 100 microlitri di surnatante da ogni pozzetto senza toccare il fondo. Infine, trasferire i surnatanti nelle provette di reazione per eseguire l'ELISA. Le cellule Af-CAR-NK-92 hanno mostrato una secrezione di interferone gamma significativamente più elevata rispetto alle cellule NK-92 simulate durante la co-coltura con provette germinali di aspergillus fumigatus.