Name: Ingegnerizzazione del recettore dellantigene chimerico-cellule natural killer mirate alle infezioni fungine utilizzando il sistema di trasposone non virale della bella addormentata (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Scopri come ingegnerizzare cellule CAR-NK contro infezioni fungine usando il sistema di trasposone Sleeping Beauty non virale. Questo metodo offre una terapia cellulare scalabile contro Aspergillus fumigatus.

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<meta charset="utf8"></head><body>Approccio della Bella Addormentata nel Bosco per ottenere cellule CAR-NK per il targeting di patogeni fungini

<ol><li>Fang, W., Latgé, J. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbe+profile%3A+Aspergillus+fumigatus%3A+A+saprotrophic+and+opportunistic+fungal+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+%28Reading%29%22%5BJournal%5D)">Microbe profile: Aspergillus fumigatus: A saprotrophic and opportunistic fungal pathogen.</a> Microbiology (Reading). 164 (8), 1009-1011 (2018).</li>
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<li>Moscarelli, J., Zahavi, D., Maynard, R., Weiner, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+next+generation+of+cellular+immunotherapy%3A+Chimeric+antigen+receptor-natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Cell+Ther%22%5BJournal%5D)">The next generation of cellular immunotherapy: Chimeric antigen receptor-natural killer cells.</a> Transplant Cell Ther. 28 (10), 650-656 (2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Provette a fondo conico da 15 ML</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td>PP, 17/120 MM, CELLSTAR, STERILE Provette</td></tr><tr><td>a fondo conico da 50 ML</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227270</td><td>PP, 30/115 MM, CELLSTAR, STERILE Piastra</td></tr> per <tr><td>coltura cellulare a 6 e 96 pozzetti</td><td>Corning Inc. LifeSciences</td><td>83-3736/ 83-3474</td><td>Piastre a pozzetti multipli trattate con TC, fondo piatto, trattate per un fissaggio ottimale delle cellule, sterilizzate mediante irradiazione gamma, </td></tr><tr><td>7-AAD (7-amminoactinomicina D)</td><td>BD biosciences</td><td>559925</td><td>colorante di acido nucleico facile da usare per l'esclusione di cellule non vitali in saggi citometrici a flusso</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anticorpo EGFR umano</td><td>Biolegend</td><td>352918</td><td>clone AY13</td></tr><tr><td>Microsfere anti-biotina UltraPure</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-105-637</td><td>Microsfere ultrapure coniugate a topo monoclonale anti-biotina anticorpi</td></tr><tr><td>Aspergillus fumigatus</td><td>ATCC</td><td>46645</td><td></td></tr><tr><td>Puntali filtranti per biosfera (20 e 100 &mu; L)&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>70.3030.365 / 70.3030.275</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>&nbsp; Modificato, senza cloruro di calcio e cloruro di magnesio, liquido, filtrato sterile, adatto alla coltura cellulare, endotossina, testato</td></tr><tr><td>ELISA MAX Deluxe Set IFN umano-&gamma;</td><td>Biolegend</td> 430104 Soluzione di sale disodico <td>dell'acido</td><td></td></tr><tr><td>etilendiamminotetraacetico (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7889</td><td>per biologia molecolare, 0,5&nbsp; M in H2O, DNasi, RNasi, NICKasi e proteasi, nessuna rilevata, 0,2 &mu; m filtrato.</td></tr><tr><td>FACS clean</td><td>BD Biosciences</td><td>340345</td><td></td></tr><tr><td>FACS Flow Sheath Fluid</td><td>BD Biosciences</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>FACS Soluzione di risciacquo</td><td>BD Bioscience</td><td>340346</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td>filtrato sterile, adatto per colture cellulari, inattivato a caldo prima dell'uso</td></tr><tr><td>Gibco, MEM &alpha;, nucleosidi</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>22571020</td><td>Rosso fenolo, Ribonucleosidi, Desossiribonucleosidi, Bicarbonato di sodio</td></tr><tr><td>Siero di cavallo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16050122</td><td>Filtrato sterile, inattivato a caldo prima dell'uso</td></tr><tr><td>IL-2 umana IS, grado di ricerca</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-742</td><td>Grado di ricerca. L'ED50 è &le; 0,3 ng/mL, corrispondente a un'attività di &ge; 3 &volte; 106 UI/mg.</td></tr><tr><td>Ionomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0634-1MG</td><td>da Streptomyces conglobatus, usato come controllo positivo per la secrezione di citochine.</td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W368401</td><td>Per colture cellulari</td></tr><tr><td>Colonna MACS LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>&nbsp; Colonne e pistoni in confezione sterile</td></tr><tr><td>NK-92</td><td>DSMZ</td><td>ACC 488</td><td></td></tr><tr><td>Neon Transfektionssystem 100&nbsp; &mu; L-Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MPK10096</td><td>Tampone di Risospensione R, Tampone Elettrolitico E2, 100 &mu; L Punte al neon, tubi per elettroporazione al neon</td></tr><tr><td>Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585-1MG</td><td>utilizzato come controllo positivo per la secrezione di citochine&nbsp;</td></tr><tr><td>Provetta in polistirene a fondo tondo, 5 mL</td><td>BD Bioscience</td><td>S-452400</td><td>utilizzata per citometria a flusso</td></tr><tr><td>Provetta di reazione, 1,5 ML</td><td>Greiner Bio-One</td><td>7,26,90,001</td><td>PP, trasparente, tappo attaccato, con graduazione iniettata. Sterilizzato prima dell'uso.</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>72400021</td><td>GlutaMax I,&nbsp; Rosso fenolo, HEPES, TipOne</td></tr><tr><td>1000 con filtro sterile &mu; Puntale con filtro graduato L XL</td><td></td><td>StarLab S1122-1730</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCalibur</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubatore C60&nbsp;</td><td>Labotect</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge 3SR</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IdroFLEX lavatrice per micropiastre&nbsp;</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoQuant Infinite M200 Pro</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neon Transfection System</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettes&nbsp;</td><td>Separatore Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quadro MACS&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ingegnerizzazione del recettore dell'antigene chimerico-cellule natural killer mirate alle infezioni fungine utilizzando il sistema di trasposone non virale della bella addormentata

Engineering Chimeric Antigen Receptor-Natural Killer Cells Targeting Fungal Infections Using the Non-viral Sleeping Beauty Transposon System

L'intero processo di generazione delle cellule Af-CAR NK-92, compresa la trasfezione, il recupero, l'arricchimento e l'espansione, richiede circa 14 giorni. Dopo la trasfezione, le cellule vengono coltivate e divise ogni due giorni. La vitalità cellulare può diminuire durante la prima scissione, due giorni dopo la trasfezione. Tipicamente, le cellule si riprendono 4 giorni dopo la trasfezione e iniziano a proliferare, con un tempo di raddoppio di 48 ore.
Dopo il recupero, vengono misurate le efficienze di trasfezione e si prevede che raggiungano il 10-20% (risultati rappresentativi mostrati nella Figura 3). L'arricchimento di cellule EGFR-positive tramite MACS aumenta la percentuale di cellule Af-CAR NK-92 a oltre il 95% (risultati rappresentativi mostrati nella Figura 4).
Per i saggi funzionali sono state utilizzate colture con oltre il 95% di cellule Af-CAR. Qui, abbiamo co-coltivato le cellule con tubi germinali di A. fumigatus per 6 ore e misurato la secrezione di IFN-ɣ come marcatore di attivazione. Come mostrato nella Figura 5, le cellule Af-CAR hanno mostrato una significativa secrezione di citochine (media = 340,6 ± 86,5 pg/mL) rispetto alle cellule Mock NK-92 (media = 75,6 ± 19,5 pg/mL), indicando un'attivazione sostanzialmente più elevata delle cellule Af-CAR (valore p = 0,03).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67424/67424fig01.jpg"> 
Figura 1: Tubi germinali di Aspergillus fumigatus. Immagine al microscopio di A. fumigatus dopo 16 ore di incubazione. I tubi germinali/piccole ife vengono osservati e distribuiti in modo omogeneo intorno al pozzetto. Barra della scala = 400 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67424/67424fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67424/67424fig02.jpg"> 
Figura 2: Co-coltura di provette germinali di Aspergillus fumigatus con cellule NK-92. Immagine al microscopio della co-coltura. Le cellule NK-92 formano cluster e sono in contatto con i tubi germinali di A. fumigatus . Barra della scala = 400 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67424/67424fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67424/67424fig03.jpg"> 
Figura 3: Efficienza di trasfezione valutata mediante colorazione per il marcatore di trasfezione EGFR. Il giorno 5, dopo l'elettroporazione, le cellule NK-92 sono state colorate con 7-AAD e anti-EGFR. I risultati sono mostrati per un esperimento rappresentativo per (A) celle Mock e (B) cellule Af-CAR NK-92. La colonna di sinistra mostra i dot plot delle dimensioni delle celle rispetto alla granularità delle celle; il cancello è impostato sulle celle NK-92. Le cellule morte vengono outgate utilizzando l'etichettatura 7-AAD (seconda colonna). La percentuale di cellule EGFR+ viventi è mostrata nella terza colonna. Abbreviazioni: EGFR = recettore del fattore di crescita epidermico; 7-AAD = 7-amminoactinomicina D; CAR = recettore chimerico dell'antigene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67424/67424fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67424/67424fig04.jpg"> 
Figura 4: Risultati della colorazione della superficie cellulare dopo l'arricchimento di cellule NK-92 che esprimono il transgene. A sinistra vengono visualizzate le celle fittizie. A destra, sono mostrate le celle Af-CAR-NK. Gli istogrammi rossi rappresentano le cellule non colorate. Gli istogrammi blu rappresentano le corrispondenti celle colorate. Il cancello è impostato sulle celle EGFR+ ; I numeri mostrano la percentuale di celle positive. Abbreviazioni: EGFR = recettore del fattore di crescita epidermico; CAR = recettore chimerico dell'antigene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67424/67424fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67424/67424fig05.jpg"> 
Figura 5: Secrezione di citochine di cellule NK attivate da tubi germinali di Aspergillus fumigatus . I diagrammi presentano i risultati della secrezione di IFN-ɣ di cellule Af-CAR e Mock in co-coltura con funghi misurata mediante ELISA dopo 6 ore di co-coltura. I dati riportati sono la media ± SD di tre esperimenti eseguiti in modo indipendente (n = 3). Valore P calcolato dal test t di Welch utilizzando GraphPad Prism 10, * p &lt; 0,05. Abbreviazioni: NK = natural killer; IFN-ɣ = interferone gamma; CAR = recettore chimerico dell'antigene; ELISA = saggio di immunoassorbimento enzimatico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67424/67424fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Nome</td>
			<td>Società</td>
			<td>Concentrazione delle scorte</td>
			<td>Riferimento</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Traduzione</td>
			<td>SB100X Mini cerchio</td>
			<td>PlasmidFactory</td>
			<td>1 μg/μl</td>
			<td>19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trasposone</td>
			<td>Plasmide Af-CAR</td>
			<td>Prodotto in casa</td>
			<td>1 μg/μl</td>
			<td>6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1: DNA utilizzato in questo protocollo.
Figura S1 supplementare: Mappa plasmidica del trasposone Af-CAR: Schema del vettore plasmidico e progettazione del trasposone CAR. Abbreviazioni: EF1 = fattore di allungamento-1 promotore alfa; ORI = origine batterica della replicazione; LIR = ripetizione invertita a sinistra; RIR: ripetizione invertita a destra; Cyto = citoplasmatico; Tm = Transmembrana. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67424/figure%20S1.pdf" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

Ingegnerizzazione del recettore dell'antigene chimerico-cellule natural killer mirate alle infezioni fungine utilizzando il sistema di trasposone non virale della bella addormentata

Chimeric antigen receptor (CAR)-based cell therapies have shown impressive efficacy in the treatment of hematological malignancies. Recently, these ...

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Immunologia e Infezioni

Questo video dimostra una tecnica per la modificazione genetica mediata da ribonucleoproteine Cas9 di cellule natural killer primarie (NK). Una ribonucleoproteina Cas9, costituita da un'endonucleasi Cas9 legata a un RNA guida (gRNA) formata dall'accoppiamento di basi di un RNA CRISPR (crRNA) e di un crRNA transattivante (tracrRNA), viene introdotta nelle cellule natural killer primarie tramite elettroporazione. La ribonucleoproteina prende di mira e scinde il DNA ospite nel sito bersaglio,...

Una tecnica per l'editing genetico nelle cellule natural killer utilizzando CRISPR Cas9

Cellule T CD19-che esprimono un recettore chimerico specifico antigene (CAR) sono infusi come trattamento sperimentale di tumori maligni delle cellule B nelle nostre prove gene first-in-umani terapia. Descriviamo modificazione genetica delle cellule T con...

Applicazione clinica della<em&gt; Bella Addormentata</em&gt; Artificiale e cellule presentanti l&#39;antigene per modificare geneticamente le cellule T da sangue del cordone ombelicale e periferico

L'obiettivo di questo studio era quello di formulare le tecnologie che permettono per la trasduzione del gene successo in primarie cellule natural killer (NK). La trasduzione lentivirale destrano-mediata di umani o risultati primari di cellule NK del mouse in una maggiore efficienza di espressione genica. Questo metodo di trasduzione del gene migliorerà notevolmente la manipolazione genetica delle cellule NK.

Destrano migliora l'efficienza di trasduzione lentivirale di cellule NK primarie Murine ed umane

Questo protocollo descrive un metodo per realizzare l'integrazione stabile di un gene di interesse nel genoma umano di sistema Sleeping Beauty trascrizionalmente regolato. Preparazione dell'integrazione dei vettori lentivirali difettosi, la trasduzione in vitro di cellule umane e l'analisi molecolare sulle cellule trasdotte sono segnalati.

Un metodo efficiente In Vitro trasposizione da un sistema di bellezza dormire trascrizionalmente regolata confezionato in un vettore lentivirale difettoso di integrazione

Qui, presentiamo un protocollo per modificare geneticamente le cellule primarie o espanso umana naturale dell'assassino (NK) utilizzando Cas9 ribonucleoproteine (Cas9/RNP). Utilizzando questo protocollo, abbiamo generato le cellule NK umane carenti per trasformare il recettore del fattore di crescita – b 2 (TGFBR2) e ipoxantina fosforibosiltransferasi 1 (HPRT1).

Generazione di cellule Knock-out NK umano primario ed espansa utilizzando Cas9 ribonucleoproteine

Qui, presentiamo un metodo per espandere il natural killer del sangue periferico (PBNK), le cellule NK dai tessuti epatici e le cellule del recettore dell'antigene chimerico (CAR)-NK derivate da cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) o sangue del cordone ombelicale (CB). Questo protocollo dimostra l'espansione delle celle NK e CAR-NK utilizzando celle di alimentazione 221-mIL-21 oltre alla purezza ottimizzata delle celle NK espanse.

Metodo di espansione cellulare Natural Killer (NK) e CAR-NK utilizzando la linea cellulare B modificata Membrane Bound-IL-21-Modified

Qui, presentiamo un metodo per differenziare ed espandere le cellule natural killer che esprimono il recettore dell'antigene chimerico (CAR) derivato da iPSC umano con una migliore uccisione contro vari tumori maligni. Questo protocollo dimostra la differenziazione e l'espansione di cellule CAR-NK derivate da iPSC ottimizzate per natural killer (NK) e la misurazione dell'attività antitumorale contro varie linee cellulari tumorali.

Progressi nelle cellule natural killer che esprimono il recettore dell'antigene chimerico derivato da cellule staminali pluripotenti umane

Questo protocollo delinea una procedura dettagliata per la generazione di cellule T del recettore chimerico dell'antigene (CAR) transitorio utilizzando mRNA non integrato per l'immunoterapia del cancro e fornisce metodi affidabili per valutare le cellule CAR-T e la loro funzione citotossica.

Un approccio non virale per generare cellule T transitorie del recettore dell'antigene chimerico utilizzando l'mRNA per l'immunoterapia del cancro

Viene fornito un protocollo dettagliato per l'utilizzo della tecnologia CRISPR/Cas9 per ottenere un knock-in mirato altamente efficiente di grandi costrutti multicistronici in cellule T umane primarie attraverso la via di riparazione del DNA HMEJ (omologia-mediata da end joining). Le cellule T ingegnerizzate con questo protocollo adattabile alle cGMP mantengono un'eccellente espansione cellulare, citotossicità e produzione di citochine.

Ingegnerizzazione non virale di cellule T umane primarie tramite integrazione mirata di giunzione terminale mediata da omologia di grandi modelli di DNA

Questo protocollo descrive i passaggi essenziali per la coltivazione delle cellule T primarie, inclusi il loro isolamento, attivazione, espansione e trasfezione transitoria tramite elettroporazione dell'mRNA. Inoltre, viene proposto un flusso di lavoro e un pannello di anticorpi per l'analisi citometrica a flusso del fenotipo, dei marcatori di attivazione, della vitalità e dell'espressione del recettore antigenico chimerico (CAR).

Isolamento, coltivazione e trasfezione transitoria delle cellule T primarie umane per generare cellule T del recettore antigenico chimerico (CAR)

Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro in vitro standardizzato per la misurazione coerente della citotossicità naturale, mediata dai recettori degli antigeni chimerici e dipendente dagli anticorpi delle cellule naturali umane, utilizzando imaging a cellule vive e citometria di flusso.

Quantificazione della citotossicità delle cellule NK potenziata dai recettori antigenici chimerici e dagli anticorpi terapeutici tramite imaging a cellule vive e citometria a flusso

Scopri come ingegnerizzare cellule CAR-NK contro infezioni fungine usando il sistema di trasposone Sleeping Beauty non virale. Questo metodo offre una terapia cellulare scalabile contro Aspergillus fumigatus.

Ingegnerizzazione del recettore dellantigene chimerico-cellule natural killer mirate alle infezioni fungine utilizzando il sistema di trasposone non virale della bella addormentata (Video) | JoVE Journal

Ingegnerizzazione del recettore dell'antigene chimerico-cellule natural killer mirate alle infezioni fungine utilizzando il sistema di trasposone non virale della bella addormentata

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