Name: Progressi nelle cellule natural killer che esprimono il recettore dellantigene chimerico derivato da cellule staminali pluripotenti umane (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-14T14:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Scopri come generare cellule NK CAR da iPSC umani con migliore attività antitumorale e persistenza in vivo. Questo protocollo avanzato supera le sfide di scalabilità e rigetto immunitario per applicazioni cliniche.

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<table><tbody><tr><td>aAPC&nbsp;</td><td>Laboratorio di Dean A. Lee</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Terreno di coltura a-MEM&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Cat#12634</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-DYKDDDDK (FLAG Tag)</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>Gatto#637308</td><td></td></tr><tr><td>APC-anti-umano TRA-1-81&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>17-8883-42&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>APC-CD16</td><td>BD Bioscienze&nbsp;</td><td>Gatto#302015</td><td></td></tr><tr><td>APC-CD43&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>Gatto# 560198&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>APC-CD45&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 555485&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>APC-GPC3</td><td>BD Bioscienze&nbsp;</td><td>Gatto#DB100B</td><td></td></tr><tr><td>APC-NKG2D&nbsp;</td><td>BD Bioscienze&nbsp;</td><td>Gatto# 558071&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Reagente per la rilevazione del verde CellEvent Caspase-3/7&nbsp;</td><td>Thermo fisher&nbsp;</td><td>Cat#C10423</td><td></td></tr><tr><td>Kit di proliferazione cellulare viola CellTrace&nbsp;</td><td>Thermo fisher&nbsp;</td><td>Cat#C34571</td><td>Colorante fluorescente per tracciamento cellulare&nbsp;</td></tr><tr><td>Soluzione CryoStor&nbsp;</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>https://www.stemcell.com/products/cryostor-cs10.html</td><td>Terreno di crioconservazione</td></tr><tr><td>CTS NK Xpander</td><td>Gibco</td><td>A5019001</td><td></td></tr><tr><td>CTS NK-Xpander</td><td>Medium Life Technologies</td><td>Cat#A5019001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco 11965084</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM, glucosio alto, integratore GlutaMAX, piruvato</td><td>Gibco</td><td>10569010</td><td></td></tr><tr><td>Kit di arricchimento di cellule NK umane EasySep&nbsp;</td><td>Tecnologie StemCell, Inc.</td><td>Gatto#19055</td><td></td></tr><tr><td>Etanolammina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9508</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Gatto# 10437010</td><td></td></tr><tr><td>FITC-CD94&nbsp;</td><td>BD Bioscienze&nbsp;</td><td>Cat#555888</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Integratore</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>GolgiPlug&nbsp;</td><td>BD Bioscienze&nbsp;</td><td>Gatto#555029</td><td></td></tr><tr><td>GolgiStop&nbsp;</td><td>BD Bioscienze&nbsp;</td><td>Cat # 554724</td><td></td></tr><tr><td>Miscela di nutrienti F-12 di Ham, integratore GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31765035</td><td></td></tr><tr><td>siero di cavallo&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Gatto#16050130</td><td></td></tr><tr><td>Siero Umano&nbsp;</td><td>Kit AB Sigma-Aldrich</td><td>Cat#BP2525100</td><td></td></tr><tr><td>NucleofectorTM per cellule staminali umane&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>Cat# VPH-5012</td><td></td></tr><tr><td>Umano: cellule HePG2</td><td>ATCC&nbsp;</td><td>Gatto#HB-8065</td><td></td></tr><tr><td>Umano: cellule HePG2-td-tomato-luc&nbsp;</td><td>Dan S. Kaufman lab</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Umano: cellule iPS</td><td>Laboratorio di Dan S. Kaufman</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Umano: cellule SNU-449</td><td>ATCC</td><td>Cat#CRL-2234</td><td></td></tr><tr><td>Umano: cellule SNU-449-td-tomato-luc&nbsp;</td><td>Dan S. Kaufman lab</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte Caspase-3/7 Saggio di apoptosi verde&nbsp;</td><td>Essenbioscience&nbsp;</td><td>Gatto # 4440</td><td></td></tr><tr><td>Acido L-ascorbico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>MP Biomedicals&nbsp; Siero umano, tipo AB</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN2938249</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR più</td><td>StemCell Technologies, Inc.</td><td>100-0276</td><td></td></tr><tr><td>Software NovoExpress&nbsp;</td><td>ACEA Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td>https://www.agilent.com/en/product/research-flow-cytometry/flow-cytometry-software/novocyte-novoexpress-software-1320805</tr><tr><td>PE/Cy7 anticorpo SSEA-4 umano&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>330420</td><td></td></tr><tr><td>PE-CD16&nbsp;</td><td>BD Bioscienze&nbsp;</td><td>Gatto#560995&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PE-CD226</td><td>BD Bioscienze&nbsp;</td><td>Gatto#559789</td><td></td></tr><tr><td>PE-CD34&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 555822&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PE-CD45&nbsp;</td><td>BD Bioscienze&nbsp;</td><td>Gatto# 555483&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PE-CD94&nbsp;</td><td>BD Bioscienze&nbsp;</td><td>Gatto#555888&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PE-cy7-CD56&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>Gatto# 318318&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Legante PE-FAS</td><td>BD Bioscienze&nbsp;</td><td>Gatto#564261&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PE-NKp30</td><td>BD Biosciences</td><td>Gatto # 558407</td><td></td></tr><tr><td>PE-NKp44&nbsp;</td><td>BD Bioscienze&nbsp;</td><td>Gatto#558563&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PE-NKp46</td><td>BD Bioscienze&nbsp;</td><td>Gatto#331908</td><td></td></tr><tr><td>PE-NKp46&nbsp;</td><td>BD Bioscienze&nbsp;</td><td>Gatto#557991&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Buffy coat del sangue periferico&nbsp;</td><td>Banca del sangue di San Diego (https://www. sandiegobloodbank.org/)&nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>PE-TRAIL&nbsp;</td><td>BD Bioscienze&nbsp;</td><td>Gatto#565499&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>pKT2-mCAG-IRES-GFP-ZEO&nbsp;</td><td>Laboratorio di Branden Moriarity</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide pMAX-GFP</td><td>Lonza</td><td>N/A</td><td>GFP controllo positivo&nbsp;</td></tr><tr><td>Prisma 9</td><td>Graphpad&nbsp;</td><td>Versione 9</td><td></td></tr><tr><td>pSpCas9&nbsp;</td><td>GenScript</td><td>PX165</td><td></td></tr><tr><td>RBC Tampone di lisi (10x)</td><td>Biolegend</td><td>Cat#420301</td><td></td></tr><tr><td>BFGF umano ricombinante di base&nbsp;</td><td>R& Sistemi D&nbsp;</td><td>Cat#4114-TC</td><td></td></tr><tr><td>BMP-4 umano ricombinante&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>Cat#120-05</td><td></td></tr><tr><td>Ligando FLT-3 umano ricombinante&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>Cat# 300-19</td><td></td></tr><tr><td>IL-15 umano ricombinante&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>Cat# 200-15</td><td></td></tr><tr><td>IL-2 umano ricombinante&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>Cat# 200-02</td><td></td></tr><tr><td>IL-3 umano ricombinante&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>Cat#200-03</td><td></td></tr><tr><td>IL-7 umano ricombinante&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>Cat# 200-07</td><td></td></tr><tr><td>Proteina nodale umana ricombinante</td><td>R& Sistemi D&nbsp;</td><td>Cat#3218-ND-025</td><td></td></tr><tr><td>SCF umano ricombinante&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>Cat# 300-07</td><td></td></tr><tr><td>TGF umano ricombinante-&beta; 1</td><td>PeproTech</td><td>Cat#100-21</td><td></td></tr><tr><td>VEGF umano ricombinante</td><td>PeproTech</td><td>Cat# 100-20</td><td></td></tr><tr><td></td><td>RPMI1640 Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>selenito di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>214485</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff APEL 2 Medium</td><td>StemCell Technologies, Inc.</td><td>5270</td><td>EB mezzo</td></tr><tr><td>di formazione STEMdiff APEL2 Medio&nbsp;</td><td>Tecnologie StemCell, Inc.</td><td>Cat#05270</td><td></td></tr><tr><td>Super piggyBac Vettore di espressione della trasposasi</td><td>SBI</td><td>Cat#PB210PA-1</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX AADvanced Dead Cell Stain Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S10274, S10349</td><td>Kit soluzione colorante per cellule morte</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanolo</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr></tbody></table>

progressi nelle cellule natural killer che esprimono il recettore dell'antigene chimerico derivato da cellule staminali pluripotenti umane

Advances in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Chimeric Antigen Receptor-Expressing Natural Killer Cells

Diagramma schematico della differenziazione e dell'espansione delle cellule NK derivate da iPSC anti-GPC3-CAR Il diagramma schematico illustra la differenziazione in vitro di cellule NK ingegnerizzate anti-GPC3-CAR derivate da cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) e una rappresentazione schematica del vettore piggyBac che trasporta il costrutto GPC3 CAR. Inizialmente, le iPSC non modificate vengono trasfettate con un vettore piggyBac che codifica per il CAR (recettore chimerico ...

Progressi nelle cellule natural killer che esprimono il recettore dell'antigene chimerico derivato da cellule staminali pluripotenti umane

Natural killer (NK) cells are innate immune cells that play a crucial role in the body's defense against tumors and viral infections. The generation of ...

advances-human-induced-pluripotent-stem-cell-derived-chimeric-antigen

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Qui si descrive un metodo per l'attivazione ed espandere cellule NKT dal bulk popolazioni di cellule T usando cellule presentanti antigene artificiali (AAPC). L'uso di CD1d basata AAPC fornisce un metodo standard per la generazione di numeri elevati di cellule NKT funzionali.

Antigen Presenting artificiale cellulare (AAPC) Attivazione mediata ed espansione delle cellule Natural Killer T

Questo video dimostra una tecnica per la generazione ex vivo di cellule T del recettore dell'antigene chimerico (CAR) antigene specifico del tumore. I vettori retrovirali che trasportano RNA transgenico vengono mescolati con le cellule della milza in un terreno integrato con interleuchina-2 per promuovere la sopravvivenza e la proliferazione delle cellule T. La miscela viene quindi trasferita su una piastra rivestita con frammenti di fibronectina umana ricombinante e centrifugata per facilitare...

Una tecnica ex vivo per generare cellule T del recettore dell'antigene chimerico tumore-specifico

Un metodo semplice ed affidabile è descritto qui di analizzare un insieme di funzioni delle cellule NK come degranulazione, citochine e chemochine ai differenti sottopopolazioni di cellule NK.

Citometria a flusso basato su test per il monitoraggio delle funzioni delle cellule NK

Descriviamo un sistema quantitativo di analisi della citolisi in vitro in tempo reale per valutare la potenza delle cellule T del recettore dell'antigene chimerico che prendono di mira le cellule tumorali liquide e solide. Questo protocollo può essere esteso per valutare altre cellule echeggiatrici immunitarie, così come i trattamenti combinati.

Un esempio di potenza in tempo reale per le cellule T del recettore dell'antigene chimerico rivolte alle cellule tumorali solide ed ematologiche

Qui, descriviamo un metodo di co-coltura in vitro di cellule di T del tumore targeting sfida in modo ricorsivo, che consente analisi fenotipica e funzionale di attività antitumorale delle cellule T.

In Vitro del tumore delle cellule Rechallenge per valutazione predittiva della funzione antitumorale chimerico antigene recettore delle cellule T

Qui, presentiamo un protocollo per l'editing genetico nelle cellule T umane primarie utilizzando la tecnologia CRISPR Cas per modificare le cellule CAR-T.

Produzione di cellule CAR-T umane ingegnerizzate CRISPR

Qui, presentiamo un metodo per espandere il natural killer del sangue periferico (PBNK), le cellule NK dai tessuti epatici e le cellule del recettore dell'antigene chimerico (CAR)-NK derivate da cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) o sangue del cordone ombelicale (CB). Questo protocollo dimostra l'espansione delle celle NK e CAR-NK utilizzando celle di alimentazione 221-mIL-21 oltre alla purezza ottimizzata delle celle NK espanse.

Metodo di espansione cellulare Natural Killer (NK) e CAR-NK utilizzando la linea cellulare B modificata Membrane Bound-IL-21-Modified

Il presente protocollo mostra come differenziare le cellule CD3−/CD45+CD56+ con citotossicità lieve dalle cellule staminali umane a potenziale espanso (hEPSC) sia in condizioni di coltura 3D che 2D. Ciò consente la convalida fenotipica di routine senza la distruzione del complesso microambiente.

Generazione di cellule Natural Killer da cellule staminali umane espanse

Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro semplificato per generare e testare cellule T regolatorie del recettore dell'antigene chimerico umano (CAR Tregs).

Generazione di cellule T regolatorie del recettore dell'antigene chimerico umano

Delineiamo un protocollo di trasfezione per la produzione di cellule CAR-NK (recettore dell'antigene chimerico-natural killer) che prendono di mira i patogeni fungini utilizzando il sistema di trasposone non virale della Bella Addormentata. Per valutare l'attivazione antigene-specifica, abbiamo co-coltivato le cellule ingegnerizzate con provette germinali di Aspergillus fumigatus e misurato la secrezione di IFN-γ.

Ingegnerizzazione del recettore dell'antigene chimerico-cellule natural killer mirate alle infezioni fungine utilizzando il sistema di trasposone non virale della bella addormentata

Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro in vitro standardizzato per la misurazione coerente della citotossicità naturale, mediata dai recettori degli antigeni chimerici e dipendente dagli anticorpi delle cellule naturali umane, utilizzando imaging a cellule vive e citometria di flusso.

Quantificazione della citotossicità delle cellule NK potenziata dai recettori antigenici chimerici e dagli anticorpi terapeutici tramite imaging a cellule vive e citometria a flusso

Scopri come generare cellule NK CAR da iPSC umani con migliore attività antitumorale e persistenza in vivo. Questo protocollo avanzato supera le sfide di scalabilità e rigetto immunitario per applicazioni cliniche.

Progressi nelle cellule natural killer che esprimono il recettore dellantigene chimerico derivato da cellule staminali pluripotenti umane (Video) | JoVE Journal

Progressi nelle cellule natural killer che esprimono il recettore dell'antigene chimerico derivato da cellule staminali pluripotenti umane

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