Spiriometria ad alta risoluzione in una camera di piccolo volume

In questo studio, vogliamo indagare se la camera di piccolo volume calibrata a 0,5 millilitri può essere utilizzata in saggi respirometrici senza compromettere l'accuratezza ottenuta per il volume classico di due millilitri nella piattaforma Oroboros.

Lo sviluppo della camera di piccolo volume e la valutazione mediante respirometria ad alta risoluzione con un rigoroso controllo di qualità mediante analisi OXPHOS di precisione hanno aperto la strada a sviluppi e nuove innovazioni, ovvero, numero uno, un respirometro O2k a 12 camere, numero due, un robot per titolazioni automatiche di sostanze in protocolli complessi applicati per l'analisi OXPHOS. Queste applicazioni saranno cruciali per l'ulteriore espansione verso l'analisi mitocondriale, la diagnosi di malattie mitocondriali, la valutazione degli sviluppi di farmaci concentrandosi sia sui benefici dei farmaci per la funzione mitocondriale che sugli effetti off-target che interrompono involontariamente la funzione mitocondriale. Quando il mio team ha sviluppato la respirometria ad alta risoluzione più di 30 anni fa, c'era un paradigma che prevedeva mitocondri, mitocondri, mitocondri. Forse c'era una differenza tra i mitocondri muscolari e quelli epatici, ma questo era tutto. Nessuno era veramente interessato ai mitocondri al di fuori di questi paradigmi. Con i nostri protocolli sviluppati per la respirometria ad alta risoluzione, abbiamo mostrato un'enorme diversità di funzioni mitocondriali. Ciò ci consente di valutare il controllo respiratorio mitocondriale in diversi tipi di cellule, tessuti e specie con un nuovo occhio. Per 30 anni fa, c'erano circa 10 pubblicazioni che lo apprezzavano. Ora, con il nostro strumento, ne abbiamo più di 1.500 che utilizzano questi protocolli.

Nella camera di piccolo volume è richiesto una quantità di campione quattro volte inferiore rispetto alla classica camera da due millilitri. In caso di campione con bassa frequenza respiratoria, la stessa quantità di campione può essere utilizzata per aumentare i flussi di ossigeno specifici del volume per ridurre l'incertezza della misura.

Il fulcro del nostro lavoro nel Laboratorio R&D di Oroboros è quello di combinare lo sviluppo strumentale e la ricerca accademica. Valutiamo la funzione respiratoria mitocondriale e i profili biogenetici con analisi multisensore. Cioè misurare la respirazione, i potenziali redox, il potenziale di membrana, l'assorbimento del calcio, la produzione di perossido di idrogeno e vari altri parametri che ci permettono di avere una visione più approfondita del profilo biogenetico e della funzione e disfunzione mitocondriale.

[Narratore] Per iniziare, monta la camera Small Volume, o SV, sull'Oroboros. Quindi accendi l'Oroboros e fai clic su Connetti per collegare l'Oroboros al software DatLab. Dopo aver asciugato completamente le camere, utilizzare una pipetta per aggiungere 0,54 millilitri di acqua nella camera SV. Quindi accendere gli agitatori. Prima di chiudere la camera, inumidire gli O-ring dei tappi, mantenendo il capillare asciutto. Allentare l'anello di calibrazione del volume, quindi inserire il tappo verso il basso fino a quando il liquido non riempie il capillare del tappo e si forma un menisco nel recipiente all'estremità superiore del capillare. Serrare l'anello di calibrazione del volume per fissarne la posizione, garantendo la coerenza del volume calibrato per inserimenti consecutivi. Per iniziare, riempire le camere con il mezzo di respirazione MiR05 Avviare il software DatLab. Seleziona il protocollo appropriato per il test strumentale in background. Impostare la velocità di rotazione dell'agitazione a 550 giri/min, il volume della camera a 0,5 millilitri, l'intervallo di registrazione dei dati a due secondi e la temperatura sperimentale a 37 gradi Celsius. Eseguire il test dell'agitatore e la calibrazione dell'aria. Impostare il segno R1 sul grafico della concentrazione di ossigeno spostando il cursore mentre si tiene premuto il tasto Shift. Di tanto in tanto, eseguire calibrazioni di ossigeno zero. Durante la calibrazione dell'aria, preparare una soluzione madre di ditionito di sodio fresca sciogliendo la polvere di O2-Zero in un tampone fosfato da 50 millimolari a una concentrazione di 2,5 millimolari per l'SV. Dopo aver completato la calibrazione dell'aria, chiudere la camera. Monitorare il segnale di ossigeno per circa 60-120 minuti, consentendo alla concentrazione di ossigeno di diminuire dalla saturazione dell'aria a circa 150 micromolari. Impostare quattro segni etichettati da J01 a J04 sul grafico negativo della pendenza dell'ossigeno. Facoltativamente, utilizzando una siringa Hamilton, titolare la soluzione di ditionito di sodio per regolare la concentrazione di ossigeno a 100 micromolari e impostare il segno J05. Per calcolare la pendenza strumentale del fondo di ossigeno in DatLab, selezionare Pendenza flusso. Quindi, apri la finestra di correzione dello sfondo dell'ossigeno e seleziona File attivo come origine dei dati di sfondo dell'ossigeno. Verificare che tutti i segni J0 siano utilizzati per il calcolo della regressione lineare. Quindi fare clic su Applica per la correzione dello sfondo dell'ossigeno. Per iniziare, lavare le camere di Oroboros con acqua deionizzata e aggiungere il mezzo MiR05 fresco nella camera. Dopo il test strumentale di base, apri una nuova scheda DatLab e seleziona il protocollo SUIT-003 per gli esperimenti sulle piastrine umane. Utilizzando la panoramica del protocollo DatLab che appare nella barra laterale Protocollo, seleziona le soluzioni stock chimiche. Quindi selezionare le siringhe Hamilton in base alle sostanze chimiche. Posizionare le siringhe sul portasiringhe con le etichette in sequenza secondo il protocollo SUIT. Per la sostituzione parziale del volume, calcolare il volume V in equivalente al volume V in uscita rimosso dal volume effettivo nella camera aperta, tenendo conto del volume morto capillare. Quindi rimuovere il tappo completamente inserito e posizionarlo sulla griglia. Rimuovere il volume V calcolato dal MiR05 dalla camera in base al tipo di cella e alla concentrazione della sospensione della cella madre. Ora, pipettare nella camera un volume equivalente della sospensione di cellule stock con una concentrazione di cellule nota. Al contrario, per una sostituzione completa del volume, aspirare l'intero fluido dalla camera. Aggiungere 0,54 millilitri dello stock di mitocondri cardiaci isolati alla camera SV. Chiudere la camera e aspirare la soluzione campione in eccesso dal recipiente del tappo. Per avviare un protocollo SUIT (Substrate Uncoupler Inhibitor Titration), aprire la finestra Eventi in DatLab per visualizzare i volumi di titolazione. Utilizzando la micro-siringa Hamilton, titolare le soluzioni chimiche madre nella camera. Quindi imposta l'evento in DatLab. Consentire la stabilizzazione del flusso dopo la titolazione. Per l'analisi dei dati, impostare un segno sulla parte rappresentativa e stabile del grafico. Il flusso di ossigeno di fondo alla saturazione dell'aria era 3,9 volte superiore nella camera da 0,5 millilitri rispetto alla camera da 2,0 millilitri, in linea con la differenza teoricamente prevista di quattro volte nel flusso di ossigeno di fondo specifico per il volume. La variabilità dei flussi strumentali di fondo era quasi identica nei due volumi da camera. Le frequenze respiratorie delle piastrine viventi, dei fibroblasti permeabilizzati e dei mitocondri isolati erano strettamente correlate in entrambi i tipi di camera quando è stata applicata l'appropriata correzione di fondo. Il flusso di ossigeno si è stabilizzato più velocemente nella camera da due millilitri rispetto alla camera da 0,5 millilitri dopo la riossigenazione. Il consumo di ossigeno residuo dopo l'inibizione del Complesso III è stato coerente tra le due camere, allineandosi con il limite di rilevamento strumentale.