Name: Spiriometria ad alta risoluzione in una camera di piccolo volume (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Impara la respirometria ad alta risoluzione con una camera da 0,5 mL per analisi della funzione mitocondriale. Questo metodo riduce il volume campione di quattro volte mantenendo accuratezza rigorosa, espandendo la ricerca su malattie mitocondriali e sviluppo farmaceutico.

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Per lo studio sulle piastrine umane, otto volontari hanno fornito il consenso informato scritto a partecipare allo studio, che è stato approvato dall'Autorità svedese per la revisione etica (n. 2013/181). Due linee cellulari di fibroblasti cutanei umani da neonati maschi sono state acquistate da ATCC e utilizzate secondo l'approvazione etica del Ministero della Salute della Repubblica Ceca (progetto: AZV MZ CR NU22-07-00474). Le procedure che coinvolgono i topi sono state condotte in conformità con la legge austriaca sulla sperimentazione animale e in conformità con la Convenzione europea per la protezione degli animali vertebrati utilizzati per scopi sperimentali e altri scopi scientifici (Tierversuchsgesetz 2012; direttiva 2010/63/UE; BMWFM-66.011/0128-WF/V/3b/2016). Il principio delle 3R è stato applicato per ridurre al minimo il numero di animali da esperimento.
1. Calibrazione del volume
<ol>
	<li>Montare le camere di piccolo volume (sV) o le camere di volume classico (cV) sugli Oroboros (Figura 1A, B; Tabella 1).</li>
	<li>Accendi l'Oroboros e connettiti a DatLab.</li>
	<li>Asciugare le camere.</li>
	<li>Pipettare 0,54 mL di H2O nel sV (0,50 mL di volume sperimentale effettivo più 0,04 mL di volume morto capillare) o 2,07 mL di H2O nel cV (2,00 mL di volume effettivo più 0,07 mL di volume morto capillare). NOTA: Per evitare perdite di liquido tra la parte superiore del cilindro di vetro e il supporto della camera in poliossimetilene (POM), inserire la punta della pipetta abbastanza in profondità da toccare la parete della camera di vetro.</li>
	<li>Accendere gli agitatori.</li>
	<li>Prima di chiudere la camera, inumidire gli O-ring dei tappi mantenendo asciutto il loro capillare. Allentare gli anelli di calibrazione del volume e inserire i tappi verso il basso fino a quando il liquido non riempie il capillare del tappo e appare una piccola goccia nel recipiente all'estremità superiore del capillare (Tabella 1).</li>
	<li>Serrare gli anelli di calibrazione del volume per fissarne la posizione in modo tale che il volume calibrato sia ottenuto in inserimenti consecutivi dei tappi.</li>
</ol>
2. Impostazione generale di Oroboros
<ol>
	<li>Avviare il software DatLab .</li>
	<li>Impostare la temperatura sperimentale (37 °C) e la velocità di rotazione dell'agitazione a 550 giri/min (9,2 Hz o rotazioni per s) nella camera sV o a 750 giri/min (12,5 Hz) nella camera cV. Impostare l'intervallo di campionamento dei dati a 2 s con livellamento superiore a 80 s (40 punti dati) nei test di fondo strumentali O2 o 40 s (20 punti dati) per la respirometria. NOTA: Le barre di agitazione magnetiche (AlNiCo rivestite in difluoruro di polivinilidene [PVDF]; Tabella 1) sono agitati da un campo magnetico rotante pulsato con un'intensità di campo di 3,5 mT a livello dell'agitatore nella camera.</li>
	<li>Eseguire la calibrazione dell'aria28 in MiR05 o nello stesso mezzo di incubazione utilizzato negli esperimenti successivi.</li>
	<li>Eseguire occasionalmente calibrazioni di ossigeno zero, ma mai immediatamente prima di iniziare gli esperimenti.<ol>
		<li>Preparare una nuova soluzione madre di Na-ditionito sciogliendo la polvere di O2-Zero in 50 mM di tampone fosfato (pH 8,0) a una concentrazione di 2,5 mM o 10 mM per le camere sV o cV , rispettivamente.</li>
		<li>Titolare Na-ditionito in eccesso per ottenere il segnale grezzo R0 o corrente zero [μA] alla concentrazione di O2 0 μM14,28.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Test strumentale di base O2
<ol>
	<li>Camera sV
	<ol>
		<li>Dopo la calibrazione dell'aria, chiudere la camera. Monitorare il segnale dell'ossigeno per circa 60 minuti fino a quando la concentrazione di O2 scende dalla saturazione dell'aria a circa 150 μM. Impostare quattro punti da J°1 a J°4 sul grafico "Pendenza O2 negativa". NOTA: Eseguire questo test strumentale di fondo O2 ogni giorno prima di iniziare un esperimento.</li>
		<li>FACOLTATIVO: Con una siringa di Hamilton, titolare il Na-ditionito preparato secondo il passaggio 2.4.1 per raggiungere una concentrazione di O2 di 100 μM (Figura 1C). NOTA: In un altro protocollo, il Na-ditionito viene titolato nella camera utilizzando la micropompa di titolazione-iniezione (TIP2k; Figura 1 supplementare e Figura 2 supplementare) per il confronto con un metodo standard per determinare il flusso di fondo strumentale O2 28.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Camera cV
	<ol>
		<li>Dopo la calibrazione dell'aria, chiudere la camera, attendere la stabilizzazione della pendenza O2 e impostare il segno J°1 sul grafico 'O2 slope neg.'28. Con una siringa di Hamilton, titolare il Na-ditionite preparato secondo il punto 2.4.1. in incrementi di 0,7 μL per adattarsi al regime diossigeno della V della camera e abbassare la concentrazione di O2 a 150 μM.</li>
		<li>Aggiungere un'altra fase di titolazione del Na-ditionito (circa 7 μL) per abbassare la concentrazione di O2 a 100 μM (Figura 1D).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analisi strumentale dei dati di fondo O2<ol>
		<li>Calcola la pendenza strumentale di fondo O2 in DatLab28. Selezionate Flusso/Pendenza (Flux/Slope ) dal menu in alto.</li>
		<li>Apri la finestra di correzione dello sfondo O2. Selezionare File attivo come sorgente dello sfondo O2 e selezionare i segni J° da utilizzare per il calcolo della regressione lineare. Applicare la correzione dello sfondo O2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67442/67442fig1v2.jpg"> 
Figura 1: Camere a volume piccolo (sV) e a volume classico (cV) e test strumentale di fondo O2. (A) Seziones V. (B) Sezione cV. (C) Tracce rappresentative di pendenza negativa e segni J°1, sV (0,5 mL; verde) e cV (2,0 mL; blu). (D) Concentrazione di ossigeno corrispondente e segni R1. Tre titolazioni manuali di Na-ditionite (ca. 0,7 μL, 10 mM di stock; cV) e titolazione finale di 7,0 μL di 2,5 mM e 10 mM di stock rispettivamente nella camera sV e cV. I picchi causati dalle titolazioni sono stati eliminati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67442/67442fig1v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
4. Aggiunta del campione alle camere Oroboros
NOTA: Il campione può essere aggiunto nella camera con due metodi: sostituzione parziale del volume (piastrine e fibroblasti nel presente studio) o sostituzione completa del volume (mitocondri isolati nel presente studio).
<ol>
	<li>Sostituzione parziale del volume<ol>
		<li>Rimuovere il tappo completamente inserito. Pipettare ed eliminare un volume Vdal MiR05. Il Vout è di 60-70 μL per le piastrine e di 80-150 μL per i fibroblasti, calcolato in base alle concentrazioni cellulari nella sospensione di cellule madre.</li>
		<li>Equivalente a Vout, pipettare lo stesso volume VJ.i di sospensione di cellule madre (con concentrazione di cellule note) nella camera (Figura 2).</li>
		<li>Calcolare la concentrazione di cellule sperimentali nel volume effettivo V' (0,54 mL e 2,07 mL), maggiore del volume sperimentale effettivo V (0,5 mL e 2,0 mL). NOTA: Le concentrazioni della sospensione della cella madre e la concentrazione della cella sperimentale devono essere pianificate in modo da ottenere volumi di VJ.i = Vout compatibili con un piccolo errore di titolazione. Negli esperimenti con le piastrine, è stato utilizzato un prototipo di tappo per la V dellacamera con un volume morto capillare di 0,05 mL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sostituzione completa del volume<ol>
		<li>Prelevare l'intero terreno dalla camera e sostituirlo con almeno 0,54 mL o 2,07 mL di soluzione madre isolata di mitocondri alla concentrazione sperimentale del campione nelle camere sV o cV, rispettivamente.</li>
		<li>Chiudere la camera e aspirare la soluzione madre mitocondriale in eccesso dal recipiente del tappo. NOTA: La sostituzione completa del volume esclude qualsiasi variabilità nella concentrazione mitocondriale che può essere sostenuta titolando nella camera chiusa attraverso il capillare del tappo con una siringa Hamilton. Quest'ultimo metodo è applicabile a campioni di piccolo diametro preparati in sospensioni madre concentrate (ad esempio, mitocondri isolati); tuttavia, espone le cellule fragili a potenziali danni delle membrane plasmatiche a causa delle forze di taglio esercitate nell'ago lungo 51 mm della siringa di Hamilton (diametro interno di 0,41 mm). Ciò viene evitato rimuovendo il tappo e pipettando il campione nella camera mediante sostituzione parziale o completa del volume. Sono stati studiati tre tipi di preparati mitocondriali. Le preparazioni campione sono descritte nel fascicolo supplementare 1 1,26,29,30.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cellule viventi: piastrine umane<ol>
		<li>Inserire i crioviali contenenti piastrine in un bagno d'acqua a 37 °C e scongelare il contenuto fino a quando non rimane poco ghiaccio.</li>
		<li>Aprire i crioviali e aggiungere 1 mL di terreno preriscaldato (DPBS + 10 mM EGTA, 37 °C) lentamente in gocce.</li>
		<li>Mescolare delicatamente le piastrine e trasferirle in una provetta da centrifuga da 50 mL con un volume totale di 10 mL di terreno preriscaldato (DPBS + 10 mM EGTA, 37 °C). Centrifugare a 1000 g per 10 min a temperatura ambiente (RT) utilizzando un rotore oscillante (accelerazione 6, freno 2).</li>
		<li>Risospendere le piastrine in 0,25 mL di DPBS + 10 mM EGTA (RT) e aggiungerle nelle camere mediante sostituzione parziale del volume a una concentrazione iniziale di cellule sperimentali compresa tra 157 · da 106 a 210 · 106 x·mL-1 nella camera da 0,5 mL e da 164 · da 106 a 220 · 106 x·mL-1 nella camera da 2,0 mL (vedere31 per i dettagli sull'unità elementare x). NOTA: Un Oroboro era equipaggiato con le camere sV e cV nelle posizioni A e B, rispettivamente, utilizzate in parallelo con un altro Oroboro equipaggiato con le camere sV e cV nelle posizioni B e A, rispettivamente.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cellule permeabilizzate: fibroblasti umani<ol>
		<li>Aggiungere le celle alle camere Oroboros mediante sostituzione parziale del volume fino a una concentrazione nominale di 0,75 · 106 x·mL-1 in entrambi i tipi di camera e calcolare la concentrazione effettiva (passaggio 4.1.3). NOTA: Diversi strumenti Oroboros sono stati utilizzati in parallelo, ciascuno dotato delle camere sV o cV .</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mitocondri isolati: cuore di topo<ol>
		<li>Aggiungere 15 μL di sospensione mitocondriale a 5985 μL di terreno di respirazione mitocondriale (MiR05), ottenendo una concentrazione di proteina mitocondriale di riserva compresa tra 0,013 e 0,026 mg∙mL-1.</li>
		<li>Aggiungere la sospensione mitocondriale alle camere Oroboros mediante sostituzione completa del volume. NOTA: Un Oroboro era equipaggiato con le camere sV e cV nelle posizioni A e B, rispettivamente, utilizzate in parallelo con un altro Oroboro equipaggiato con le camere sV e cV nelle posizioni B e A, rispettivamente.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67442/67442fig02.jpg"> 
Figura 2: Aggiunta della sospensione cellulare mediante sostituzione parziale del volume. (A) Aggiunta nella camera da 0,5 mL sV e (B) nella camera da 2,0 mL cV. (1) Camera chiusa con volumi di mezzo di respirazione V e tappo riempito capillare Vstc, per la misurazione del fondo strumentale O2 flusso JO2°. (2) Tappo rimosso, Vstc scaricato nella camera con conseguente volume totale V'= V+Vstc. (3) Rimozione parziale del fluido Vout = -V J.i. Nella camera rimane un volume V''= V'+Vout. (4) Pipettare il sottocampione con volume V J.i di sospensione respirometrica di cellule madre nella camera, ottenendo un volume totale V# = V+Vstc di sospensione cellulare diluita. (5) Camera chiusa con capillare di tappo riempito (volume morto Vstc) per la misura del flusso di O2 volume-specifico JV,O 2 in un volume sperimentale V. Questa cifra è stata modificata rispetto alla Figura 2A in Conteggio cellulare e normalizzazione in HRR41. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67442/67442fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
5. Protocolli SUIT
<ol>
	<li>Titolare le soluzioni madre delle sostanze chimiche elencate nella Tabella supplementare 1 nelle camere con microsiringhe Hamilton, regolando i volumi di titolazione per ottenere le stesse concentrazioni sperimentali nelle camere sV e cV (vedere le legende delle figure 6, 8, 10).</li>
	<li>Selezionare il protocollo SUIT-003_D018 32,33 (per le piastrine nel presente studio).</li>
	<li>Selezionare i protocolli SUIT-001_D004 4,15,34,35 e SUIT-002_D007 4,15,35,36 (per i fibroblasti nel presente studio).</li>
	<li>Seleziona il protocollo SUIT-002_D005 4,15,35,37 (per mitocondri isolati nel presente studio).</li>
</ol>
6. Analisi dei dati SUIT
<ol>
	<li>In DatLab, impostare i contrassegni per definire le sezioni dei grafici selezionati.</li>
	<li>Selezionate Flusso/Pendenza (Flux/Slope ) nel menu in alto. Aprire la finestra Flusso/Inclinazione . Applicare la correzione del volume di titolazione per la diluizione dei campioni sospesi mediante ciascuna titolazione nel protocollo SUIT.</li>
	<li>Seleziona Indicatori dal menu in alto. Statistiche Open Mark per mostrare la mediana dei punti dati contrassegnati al basale corretta per sottrazione del consumo di ossigeno residuo (rox).</li>
	<li>Calcola l'intercetta e la pendenza tra i risultati accoppiati ottenuti nelle camere sV e cV mediante analisi di regressione invertita25,28 utilizzando un foglio di calcolo.</li>
	<li>Confrontare le frequenze respiratorie nello stato rox (flussi minimi di O2) nelle camere sV e cV con un t-test di Student accoppiato utilizzando il software jamovi 2.3.1338. NOTA: Poiché le due camere di uno strumento Oroboros sono funzionalmente indipendenti (ad eccezione della temperatura e degli intervalli di registrazione DatLab), le misurazioni in ciascuna camera possono essere considerate separatamente, in modo simile all'utilizzo di strumenti diversi. I risultati finali possono essere riportati come mediane o medie di più camere con informazioni sulla loro variabilità.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Esplorazione dei volumi camerali per la respirometria mitocondriale ad alta risoluzione

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<li>Oroboros Instruments SUIT-001 O2 ce-pce D004. , 
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<li>Oroboros Instruments SUIT-002 O2 mt D005. , 
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</ol>

<table><tbody><tr><td>Anaconda3</td><td>Anaconda Software Distribution</td><td>https://www.anaconda.com/</td> <td>software</td></tr><tr><td>ADP</td><td>Merck, Germania</td><td>117105</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotici-antimicotici 100x</td><td>Biosera, Francia</td><td>XC-A4110</td><td>ATTENZIONE H317 Può causare una reazione allergica cutanea</td></tr><tr><td>Antimicina A</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>A8674</td><td>ATTENZIONE H300&nbsp; Fatale se ingerito, H400 pericolo acquatico a breve termine (acuto)&nbsp;</td></tr><tr><td>Ascorbato</td><td>Sigma-Aldrich, Stati Uniti</td><td>A7631</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich, Stati Uniti</td><td> A 2383</td><td></td></tr><tr><td>BSA senza acidi grassi</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>A 6003</td><td>albumina sierica bovina</td></tr><tr><td>CaCO3</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>C 4830</td><td></td></tr><tr><td>CCCP</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>C2759</td><td>cianuro di carbonile m-clorofenil idrazone ATTENZIONE H301 + H311 + H331 Tossico se ingerito, a contatto con la pelle o se inalato</td></tr><tr><td>Countess Contatore cellulare automatizzato&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific, Stati Uniti</td><td>AMQAX100</td><td></td></tr><tr><td>Citocromo c</td><td>Sigma-Aldrich, Stati Uniti</td><td>C7752</td><td></td></tr><tr><td>DatLab&nbsp;</td><td>Oroboros Instruments, Austria</td><td>Versione 7.4</td><td>Software per l'acquisizione e l'analisi dei dati</td></tr><tr><td>DatLab&nbsp;</td><td>Oroboros Instruments, Austria</td><td>Versione 8.1</td><td>Software per l'acquisizione e l'analisi dei dati</td></tr><tr><td>DC Protein Assay</td><td>Bio-Rad, USA</td><td>5000112</td><td>Kit per il dosaggio delle proteine; ATTENZIONE H314 Provoca gravi ustioni cutanee e lesioni agli occhi</td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>D5628</td><td>ATTENZIONE H301 Tossico se ingerito</td></tr><tr><td>Ditiotreitolo</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>D 0632</td><td>ATTENZIONE H318 Provoca gravi danni agli occhi</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Pan Biotech, Germania</td><td>P04-05551</td><td>Dulbecco' s Eagle modificato' s medium</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>D2650</td><td>dimetilsolfossido</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Lonza Bioscience, Svizzera</td><td>LONBE17-512F</td><td>Dulbecco' senza calcio s soluzione salina tamponata con fosfato</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>E 4378</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>A5256701</td><td>siero fetale bovino</td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma-Aldrich, USA&</td><td>nbsp; G7528</td><td></td></tr><tr><td>Glutammato</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>G1626</td><td></td></tr><tr><td>Glicerofosfato</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-215789</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge 3s Large</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>Centrifuga HM3S</td><td></td></tr><tr><td>Hettich Rotina 380R&nbsp;</td><td>Andreas Hettich GmbH & Co. KG, Germania</td><td>1701</td><td>centrifuga</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Honeywell Fluka, Austria</td><td>56750</td><td>ATTENZIONE H302 Nocivo se ingerito, H314 Provoca gravi ustioni cutanee e danni agli occhi, H360D Può danneggiare il nascituro</td></tr><tr><td>jamovi&nbsp;</td><td>Il progetto jamovi</td><td>Versione 2.3.13</td><td>software</td></tr><tr><td>K+-MES</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>M 8250</td><td></td></tr><tr><td>Leucosep tubo&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Austria</td><td>Z642843-300EA</td><td>provetta da centrifuga con barriera in polietilene</td></tr><tr><td>Malato</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>M1000</td><td>ATTENZIONE H319 Provoca grave irritazione agli occhi.</td></tr><tr><td>Mannitolo</td><td>Sigma-Aldrich, Stati Uniti</td><td>M 4125</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&nbsp;</td><td>Scharlau, Spagna</td><td>MA 0036</td><td></td></tr><tr><td>MiR05-Kit</td><td>Oroboros Instruments, Austria</td><td>60101-01</td><td>Mezzo di respirazione mitocondriale</td></tr><tr><td>Miscelatore&nbsp;</td><td>Swelab Instruments, Svezia</td><td>Tavolo a dondolo</td><td>440S</td></tr><tr><td>Mr. Frosty Freezing Container Thermo</td><td>Fisher Scientific, USA</td><td>5100-0001</td><td>Freezing Container</td></tr><tr><td>Oroboros</td><td>Oroboros Instruments, Austria</td><td></td><td>il NextGen-O2k e l'O2k sono indicati collettivamente con il termine " Di Oroboros</td></tr><tr><td>Camera Oroboros cV</td><td>Oroboros Instruments, Austria</td><td>23100-01</td><td>camera a volume classico</td></tr><tr><td>Camera Oroboros sV</td><td>Oroboros Instruments, Austria</td><td>33100-01</td><td>camera a volume ridotto</td></tr><tr><td>Oroboros TIP2k-Module</td><td>Oroboros Instruments, Austria</td><td>11100-03</td><td>Micropompa per titolazione-iniezione</td></tr><tr><td>O2-Zero Powder</td><td>Oroboros Instruments, Austria</td><td>Codice 26600-02</td><td>&nbsp; Na-ditionito ATTENZIONE H251 Autoriscaldante: può prendere fuoco, H302 Nocivo se ingerito, H319 Provoca grave irritazione oculare</td></tr><tr><td>ottanoylcarnitina</td><td>Biotrend - APExBIO Technology, Germania</td><td>B6371</td><td></td></tr><tr><td>Oligomicina</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>O4876</td><td></td></tr><tr><td>Fosfocreatina</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>P 7936</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>P2256</td><td>ATTENZIONE H317 Può causare una reazione allergica cutanea</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>R8875</td><td>ATTENZIONE H300 Fatale se ingerito</td></tr><tr><td>Linee cellulari di fibroblasti cutanei&nbsp;</td><td>&nbsp; ATCC, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodio azide</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>S2002</td><td>ATTENZIONE H300 + H310 + H330 Fatale se ingerito, a contatto con la pelle o se inalato</td></tr><tr><td>Subtilisin A</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>P 5380</td><td>ATTENZIONE H318 - Provoca gravi lesioni oculari, H334 - Può causare sintomi di allergia o asma o difficoltà respiratorie se inalato</td></tr><tr><td>Succinato</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>S2378</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>S 7903</td><td></td></tr><tr><td>Contatore di cellule del sangue Swelab Alfa</td><td>Boule Diagnostics AB, Svezia</td><td>1420041</td><td></td></tr><tr><td>Taurina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>T 0625</td><td></td></tr><tr><td>Tecan Infinite TM F200</td><td>Tecan, Svizzera</td><td></td><td>spettrofotometro</td></tr><tr><td>TMPD</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>T3134</td><td>N,N,N',N'-Tetrametil-p-fenilendiammina dicloridrato ATTENZIONE H315 Provoca irritazione cutanea, H319 Provoca grave irritazione oculare</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>T4799</td><td>ATTENZIONE H334 Può causare sintomi di allergia o asma o difficoltà respiratorie se inalato</td></tr><tr><td>Vacuette</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Austria</td><td>15452520</td><td></td></tr></tbody></table>

spiriometria ad alta risoluzione in una camera di piccolo volume

High-Resolution Respirometry in a Small-Volume Chamber

Spiriometria ad alta risoluzione in una camera di piccolo volume

Investigating respiratory fluxes is decisive for understanding the complex interplay between metabolic processes. Studies of cells and tissues with ...

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Ad alta risoluzione respirometria è utilizzato per determinare il consumo di ossigeno mitocondriale. Questa è una tecnica semplice per determinare mitocondriale complessi della catena respiratoria '(I-IV) frequenza respiratoria, la capacità del sistema di trasporto degli elettroni mitocondriale massima, e l'integrità della membrana mitocondriale esterna.

Ad alta risoluzione respirometria mitocondriale per valutare la funzione in permeabilizzate e cellule intatte

Qui, un campione di muscolo quadricipite viene prelevato da un maiale anestetizzato e i mitocondri vengono isolati mediante centrifugazione differenziale. Quindi, le frequenze respiratorie dei complessi della catena respiratoria mitocondriale I, II e IV vengono determinate utilizzando la respirometria ad alta risoluzione.

L&#39;isolamento di mitocondri intatti dal muscolo scheletrico mediante centrifugazione differenziale per alta risoluzione respirometria Misure

L'obiettivo del presente protocollo è quello di misurare l'effetto delle modifiche del glucosio-mediata di respirazione mitocondriale in presenza di composti naturali sulle cellule beta intatto 832/13 utilizzando manometrica ad alta risoluzione.

Respirometry ad alta risoluzione per misurare la funzione mitocondriale di cellule Beta intatte in presenza di composti naturali

Questo protocollo descrive calorespirometry, la misura diretta e simultanea di dissipazione di calore e di respirazione, che fornisce un approccio non invasivo per valutare il metabolismo energetico. Questa tecnica è utilizzata per valutare il contributo delle vie sia aerobiche e anaerobiche per l'utilizzazione di energia di monitoraggio del flusso totale di energia cellulare.

Calorespirometry: Un approccio potente, non invasivo per studiare il metabolismo energetico cellulare

Questo protocollo presenta la costruzione e l'uso di un apparato di pletismografia semplificata di tutto il corpo per monitorare la progressione della malattia respiratoria batterica in modo non invasivo.

Pletismografia semplificata di tutto il corpo per caratterizzare la funzione polmonare durante la melioidosi respiratoria

La valutazione della fosforilazione ossidativa mediante respirometri ad alta risoluzione è diventata parte integrante dell'analisi funzionale dei mitocondri e del metabolismo energetico cellulare. Qui, presentiamo protocolli per l'analisi del metabolismo energetico cellulare utilizzando respirometri ad alta risoluzione basati su camera e micropiastre e discutiamo i principali vantaggi di ciascun dispositivo.

Respirometria ad alta risoluzione per valutare la bioenergetica nelle cellule e nei tessuti utilizzando respirometri a camera e a piastre

Questo protocollo descrive la messa a punto e il funzionamento di un sistema di micro-respirometria che può essere impiegato per studiare le caratteristiche fisiologiche dell'olobionte corallo.

Caratterizzazione fisiologica dell'olobionte di corallo mediante un nuovo strumento di micro-respirometria

L'analisi della funzione mitocondriale degli spermatozoi mediante respirometria ad alta risoluzione consente di misurare il consumo di ossigeno degli spermatozoi che si muovono liberamente in un sistema a camera chiusa. La tecnica può essere applicata per misurare la respirazione negli spermatozoi umani, che fornisce informazioni sulle caratteristiche e sull'integrità mitocondriale degli spermatozoi.

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Qui, descriviamo un metodo completo per misurare la fosforilazione ossidativa mitocondriale in fibre muscolari scheletriche fresche permeabilizzate da muscolo umano o di topo. Questo metodo consente la quantificazione in tempo reale della respirazione mitocondriale e la valutazione della preferenza per il carburante e della flessibilità metabolica, preservando le reti mitocondriali esistenti e l'integrità della membrana.

Misurazione della respirazione mitocondriale nelle fibre muscolari scheletriche umane e di topo mediante repirometria ad alta risoluzione

In questo articolo il video, si descrive un metodo nuovo che consente la costruzione di gradienti di odorizzante con geometrie stabili e controllabili. Abbiamo brevemente illustrare come questi gradienti possono essere usati per lo screening dei difetti olfattivi (anosmia totale e parziale) e di studiare le caratteristiche più sottili del comportamento chemiotassi.

Ad alta risoluzione misurazione del comportamento Odor-Driven in Larve Drosophila

Impara la respirometria ad alta risoluzione con una camera da 0,5 mL per analisi della funzione mitocondriale. Questo metodo riduce il volume campione di quattro volte mantenendo accuratezza rigorosa, espandendo la ricerca su malattie mitocondriali e sviluppo farmaceutico.

Spiriometria ad alta risoluzione in una camera di piccolo volume

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