Screening in vitro basato su LED per la valutazione di molecole fotoattivabili nell'inattivazione fotodinamica batterica

La mia ricerca è focalizzata sull'esplorazione di diverse molecole della famiglia dei composti flavilici, sia naturali che sintetici, con un interesse fondamentale nello studio della loro bioattività nel contesto della fotoprotezione UV e nella valutazione del loro potenziale come fotosensibilizzanti per applicazioni di terapia fotodinamica. I recenti risultati del nostro gruppo di ricerca hanno dimostrato le proprietà attivate dalla luce dei coloranti flavylium a base di aminoacidi, affermandoli come una nuova promettente classe di fotosensibilizzanti. Questi composti mostrano un potenziale significativo per ulteriori esplorazioni, aprendo la strada ad applicazioni innovative nel campo.

Utilizzando il sistema di micropiastre e pannelli luminosi a 96 pozzetti, possiamo ottenere uno screening ad alta produttività di fotosensibilizzatori in un ambiente controllato, semplificando l'identificazione e il confronto tra diversi candidati per la terapia fotodinamica. Per iniziare, introdurre i batteri Staphylococcus aureus sulla piastra di agar Mueller-Hinton dalla coltura di arresto. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 24 ore per ottenere una coltura fresca.

Raccogliere due o tre colonie fresche dalla piastra di agar e diluirle in sei millilitri di PBS filtrato sterile preriscaldato a pH 7,4. Agitare l'inoculo a 1.200 giri al minuto per tre o quattro cicli per omogeneizzare il campione e prelevare tre millilitri di inoculo omogeneizzato in una cuvetta monouso. Dopo aver misurato la densità ottica a 600 nanometri, diluire il campione in modo che corrisponda alla densità ottica di 0,1 utilizzando PBS.

Preparare una soluzione madre del composto fotosensibilizzante in un solvente appropriato come DMSO o PBS. Diluire la soluzione madre in PBS per creare la soluzione di lavoro, assicurandosi che i componenti del terreno di coltura batterica non interferiscano con l'assorbimento della luce. Vortex la soluzione di lavoro per garantire una completa omogeneizzazione.

Per iniziare, preparare la sospensione di Staphylococcus aureus e la soluzione di lavoro del composto fotosensibilizzante. Preparare due piastre separate da 96 pozzetti, una designata per l'esposizione alla luce e l'altra per il controllo al buio. In ogni piastra, erogare 100 microlitri ciascuno della soluzione fotosensibilizzante e della sospensione batterica.

Mescolare le soluzioni da 5 a 10 volte con la pipetta. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 30 minuti per consentire al fotosensibilizzante di interagire con le cellule batteriche. Dopo l'incubazione, rimuovere le piastre dall'incubatrice.

Tenere una delle piastre al riparo dall'esposizione alla luce come controllo al buio. Posizionare l'altra piastra a 96 pozzetti sopra il pannello LED rettangolare da 50 watt. Contrassegnare i bordi della piastra sulla superficie del LED per garantire un posizionamento coerente tra le ripetizioni del protocollo.

Esporre la piastra alla luce LED per circa 15 minuti. Utilizzare un'altra piastra da 96 pozzetti per preparare diluizioni seriali dei campioni, compresi i pozzetti di controllo, non irradiati e irradiati. Aggiungere 180 microlitri di PBS a ciascun pozzetto, in base al numero di campioni.

Aliquotare 20 microlitri da ciascun pozzetto nelle piastre irradiate e non irradiate nella prima colonna della piastra riempita di PBS. Utilizzando una micropipetta multicanale, eseguire una semplice diluizione seriale dal pozzetto 1 al pozzetto 6. Dividere una piastra di agar in sei sezioni uguali, ciascuna delle quali corrisponde a una delle diluizioni.

Aliquotare 10 microlitri da ciascun pozzetto sulla sezione corrispondente della piastra di agar. Incubare la piastra per 18-20 ore. Rimuovere la piastra di agar dall'incubatrice e identificare le aree adatte al conteggio delle colonie.

All'interno di ogni sezione della piastra della coclea, contare il numero di unità formanti colonie. Lo spettro della gamma della luce visibile ha mostrato tre picchi distinti tra 400 e 700 nanometri. In condizioni di oscurità, nessuno dei composti di flavilio testati ha mostrato effetti citotossici.

Al contrario, dopo l'esposizione alla luce, i composti testati hanno causato una diminuzione dose-dipendente della vitalità dello Staphylococcus aureus con effetti significativi osservati a concentrazioni di 6 e 12 micromolari.