Name: Marcatura a fluorescenza per visualizzare le proteine a bassa espressione nel pesce zebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-24T14:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Scopri la marcatura a fluorescenza per visualizzare proteine a bassa espressione in Danio rerio. Questo metodo semplifica la costruzione del donatore e migliora l'imaging proteico in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Marcatura fluorescente delle proteine nelle larve di zebrafish utilizzando CRISPR/Cas9 Knock-In

<ol><li>Brittijn, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+development+and+regeneration%3A+new+tools+for+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish development and regeneration: new tools for biomedical research.</a> Int J Dev Biol. 53 (5-6), 835-850 (2009).</li>
<li>Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+for+complex+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model for complex tissue regeneration.</a> Trends Genet. 29 (11), 611-620 (2013).</li>
<li>Haraoka, Y., Miyake, M., Ishitani, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+imaging+reveals+hidden+oncogenic-normal+cell+communication+during+primary+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">Zebrafish imaging reveals hidden oncogenic-normal cell communication during primary tumorigenesis.</a> Cell Struct Funct. 48 (1), 113-121 (2023).</li>
<li>Gomes, M. C., Mostowy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+case+for+modeling+human+infection+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The case for modeling human infection in zebrafish.</a> Trends Microbiol. 28 (1), 10-18 (2020).</li>
<li>Trede, N. S., Langenau, D. M., Traver, D., Look, A. T., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+zebrafish+to+understand+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The use of zebrafish to understand immunity.</a> Immunity. 20 (4), 367-379 (2004).</li>
<li>Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+transparent+zebrafish%3A+a+refined+method+to+improve+detection+of+gene+expression+during+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mar+Biotechnol+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development.</a> Mar Biotechnol (NY). 3 (6), 522-527 (2001).</li>
<li>White, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).</li>
<li>Antinucci, P., Hindges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+crystal-clear+zebrafish+for+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging.</a> Sci Rep. 6, 29490(2016).</li>
<li>He, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+ligase+3-dependent+microhomology-mediated+end+joining+repair+of+DNA+double-strand+breaks+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient ligase 3-dependent microhomology-mediated end joining repair of DNA double-strand breaks in zebrafish embryos.</a> Mutat Res. 780, 86-96 (2015).</li>
<li>Hisano, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+in-frame+integration+of+exogenous+DNA+mediated+by+CRISPR%2FCas9+system+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Precise in-frame integration of exogenous DNA mediated by CRISPR/Cas9 system in zebrafish.</a> Sci Rep. 5, 8841(2015).</li>
<li>Luo, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-based+genome+engineering+of+zebrafish+using+a+seamless+integration+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-based genome engineering of zebrafish using a seamless integration strategy.</a> FASEB J. 32 (9), 5132-5142 (2018).</li>
<li>Wierson, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeted+integration+directed+by+short+homology+in+zebrafish+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Efficient targeted integration directed by short homology in zebrafish and mammalian cells.</a> Elife. 9, e53968(2020).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+tagging+strategies+for+illuminating+expression+profiles+of+genes+with+different+abundance+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimal tagging strategies for illuminating expression profiles of genes with different abundance in zebrafish.</a> Commun Biol. 6 (1), 1300(2023).</li>
<li>Li, C., Evans, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligation+independent+cloning+irrespective+of+restriction+site+compatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Ligation independent cloning irrespective of restriction site compatibility.</a> Nucleic Acids Res. 25 (20), 4165-4166 (1997).</li>
<li>Yu, C., Zhang, Y., Yao, S., Wei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+PCR+based+protocol+for+detecting+indel+mutations+induced+by+TALENs+and+CRISPR%2FCas9+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A PCR based protocol for detecting indel mutations induced by TALENs and CRISPR/Cas9 in zebrafish.</a> PLoS One. 9 (6), e98282(2014).</li>
<li>Hirata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+39.9+protein+is+necessary+for+coordinated+activation+of+slow-twitch+muscle+and+normal+behavior+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Connexin 39.9 protein is necessary for coordinated activation of slow-twitch muscle and normal behavior in zebrafish.</a> J Biol Chem. 287 (2), 1080-1089 (2012).</li>
<li>Cason, N., White, T. W., Cheng, S., Goodenough, D. A., Valdimarsson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning%2C+expression+analysis%2C+and+functional+characterization+of+connexin44.1%3A+a+zebrafish+lens+gap+junction+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning, expression analysis, and functional characterization of connexin44.1: a zebrafish lens gap junction protein.</a> Dev Dyn. 221 (2), 238-247 (2001).</li>
<li>Urushibata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+developmental+speed+in+zebrafish+embryos+using+different+incubation+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Control of developmental speed in zebrafish embryos using different incubation temperatures.</a> Zebrafish. 18 (5), 316-325 (2021).</li>
<li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+digestion+and+ligation-mediated+PCR+used+for+flanking+sequence+walking%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Cyclic digestion and ligation-mediated PCR used for flanking sequence walking.</a> Sci Rep. 10 (1), 3434(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1000 &micro; L&nbsp; punte</td> N<td>/A</td><td>di qualsiasi marca</td><td>Per tutte le manipolazioni Provette</td></tr> da <tr><td>1,5 mL</td><td>N/A</td> di <td>qualsiasi marca</td><td>Per la conservazione e la centrifugazione di varie soluzioni</td></tr><tr><td>Provette da 1,5 mL (senza RNasi)</td>N<td>/A</td> <td>di qualsiasi marca</td><td>Per la conservazione e la centrifugazione di soluzioni prive di RNasi</td></tr><tr><td>10 &; L punte</td><td>Qualsiasi marca</td><td>N/A</td><td>Per tutte le manipolazioni</td></tr><tr><td>10 & micro; Punte a L (senza RNasi)</td><td>Qualsiasi marca</td><td>N/A</td><td>Per manipolazioni senza RNasi</td></tr><tr><td>1000 & micro; L&nbsp; punte (senza RNasi)</td><td>Qualsiasi marca</td><td>N/A</td><td>Per manipolazioni senza RNasi</td></tr><tr><td>1-fenil 2-tiourea (PTU)</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td>Per inibire la melanogenesi e mantenere le larve trasparenti</td></tr><tr><td>200 &; L punte</td><td>Qualsiasi marca</td><td>N/A</td><td>Per tutte le manipolazioni</td></tr><tr><td>200 &micro; Punte L (senza RNasi)</td><td>Qualsiasi marca</td><td>N/A</td><td>Per manipolazioni senza RNasi</td></tr><tr><td>2x Taq Plus Master Mix II (Dye Plus)</td><td>Vazyme</td><td>P213-03</td><td>PCR per test di efficienza sgRNA</td></tr><tr><td>Piastre da 35 mm</td><td>Corning</td><td>430165 Per l'imaging</td><td></td></tr><tr><td>di piastre a 6 pozzetti</td><td>Qualsiasi marca</td><td>N/A</td><td>Per l'allevamento di zebrafish individualmente e temporaneamente</td></tr><tr><td>Acc65I</td><td>NEB</td><td>R0599S</td><td>Per digestione enzimatica</td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>Sigma</td><td>695092</td><td>Per la preparazione di tamponi TAE</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Biofroxx</td><td>8211GR500</td><td>Per piastre LB</td></tr><tr><td>Ampicillina, sale sodico</td><td>Sangon</td><td>A610028</td><td>Per piastre LB</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C5080</td><td>Per la preparazione di tamponi embrionali</td></tr><tr>Tubi<td>capillari</td><td>Apparecchio</td> <td>Harvard30-0016</td><td>Per la generazione di aghi per iniezione</td></tr><tr><td>Provette capillari</td><td>Qualsiasi marca</td><td>ID (diametro interno) = 0,1 mm</td><td>Per quantificare una goccia da 1 nL</td></tr><tr><td>CRISPRscan</td><td>CRISPRscan</td><td>&nbsp; http://www.crisprscan.org/</td> <td>Per la progettazione di sgRNA</td></tr><tr><td>DH5&alfa;</td><td>TIANGEN</td><td>CB101</td><td>Per la trasformazione</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td>Per la preparazione del tampone di lisi e del tampone TAE</td></tr><tr><td>Ensembl</td><td>Ensembl</td><td> https://asia.ensembl.org/Danio_rerio/Info/Index</td><td>Per trovare informazioni sui geni</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>HUSHI</td><td>64-17-5</td><td>Per la purificazione e l'estrazione del DNA</td></tr><tr><td>Esonucleasi III</td><td>Takara</td><td>2170A</td><td>LIC</td></tr><tr><td>Microiniettore alimentato a gas</td><td>Warner Instruments</td><td>PLI-100A</td><td>Per microiniezione</td></tr><tr><td>Sistema di elettroforesi su gel</td><td></td><td>WIX WIX-EP3000</td><td>Per gel Guanti per elettroforesi</td></tr><tr><td></td><td>Qualsiasi marca</td><td>N/A</td><td>Per tutte le manipolazioni</td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>sgdbio</td><td>10010518</td><td>Per piastre LB</td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sangon</td><td>A501745</td><td>Per piastre LB</td></tr><tr><td>gRNA-pMD19-T</td><td>China Zebrafish Resource Center (CZRC)</td><td>Plasmide sgRNA CZP3 contenente impalcatura sgRNA</td><td></td></tr> <tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>Per embrione preparazione</td></tr><tr>del<td>tampone Soluzione di precipitazione al cloruro di litio</td><td>Thermofisher</td><td>AM9480</td><td>Precipitazione di sgRNA, senza RNasi</td></tr><tr><td>Agarosio a basso punto di fusione</td><td>Sangon</td><td>A600015</td><td>Per la preparazione di gel di agarosio al 4%</td></tr><tr><td>Solfato di magnesio</td><td>sgdbio</td><td>20025118</td><td>Per piastre LB</td></tr><tr><td>Bagno metallico</td><td>Qualsiasi marca</td><td>N/A</td><td>Per incubazione a temperatura costante</td></tr><tr><td>Blu di metilene</td><td>Sigma</td><td>M9140</td><td>Per la preparazione del tampone embrionale</td></tr><tr><td>Stampo per microineccitazione</td><td>Fatto in casa</td><td>N/A</td><td>Per generare scanalature per trattenere gli embrioni durante la microiniezione</td></tr><tr><td>Microloader, punta per il riempimento di Femtotips e altri microcapillari di vetro, sterile, 0,5 - 20 &; L, 100 mm, grigio chiaro, 192 pz. (2 rack e tempi; 96 pz.)</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>Per caricare la soluzione di microiniezione nell'ago per iniezione, estrattore</td></tr><tr><td>per micropipette</td> senza RNasi <td>Strumento</td><td>Sutter P-97</td><td>Per la generazione di aghi per iniezione</td></tr><tr><td>Micropipette</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td>Per tutte le manipolazioni</td></tr><tr><td>Microonde</td><td>Qualsiasi marca</td><td>N/A</td><td>Per la colata di piastre per iniezione e gel di agarosio</td></tr><tr><td>MinElute PCR Kit di purificazione (50)</td><td>QIAGEN</td><td>28004</td><td>Per purificare i prodotti della PCR e i prodotti della digestione, mMESSAGE mMACHINE T3 senza RNasi</td></tr><tr>Kit<td>di trascrizione</td><td>Invitrogen</td><td>AM1348</td><td>Trascrizione in vitro dell'mRNA Cas9,</td></tr> N<tr><td>2</td><td>Qualsiasi marca</td><td>N/A</td><td>Per microiniezione</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td>Per la preparazione del tampone embrionale e del tampone di lisi</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>Per la preparazione di tamponi embrionali</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sangon</td><td>A100173</td><td>Per la preparazione di tamponi TAE</td></tr><tr><td>Acqua priva di nucleasi</td><td>Thermofisher</td><td>R0581</td><td>Manipolazioni correlate all'RNA, senza RNasi</td></tr><tr><td>PciI</td><td>NEB</td><td>R0655S</td> Per macchina PCR <td>per digestione enzimatica</td></tr><tr><td></td><td>Qualsiasi marca</td><td>N/A</td><td>Provette</td></tr><tr><td>per strisce PCR</td> di <td>amplificazione PCR Qualsiasi marca</td><td>N/A</td><td>Per provette</td></tr><tr><td>PCR</td><td>FEITONGKANG</td><td>blp-200</td><td>Per piastra</td></tr><tr><td>di Petri</td> PCR <td>Qualsiasi marca</td><td>N/A</td><td>Per l'allevamento di larve di pesce zebra ecc.</td></tr><tr><td>Rosso fenolo</td><td>Sigma</td><td>P0290</td><td>Per microiniezione, senza RNasi</td></tr><tr><td>Porta pipetta</td><td>Warner Instruments</td><td>PLI-PH1</td><td>Per microiniezione</td></tr><tr><td>PrimeStar (Premix)</td><td>Takara</td><td>DR040A</td><td>Per clonazione molecolare</td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>Merck</td><td>539480</td><td>Per l'estrazione del DNA genomico</td></tr><tr><td>pT3TS (T3:zCas9-UTRglobin)</td><td>China Zebrafish Resource Center (CZRC)</td> Modello <td>di plasmide</td> <td>CZP11</td> Cas9</tr><tr><td>Centrifuga refrigerata</td><td>Qualsiasi marca</td><td>N/A</td><td>Per centrifugazione correlata all'RNA</td></tr><tr><td>Scala</td><td>Sartorius</td><td>BCE124-1CCN</td><td>Per la colata di piastre di iniezione e gel di agarosio</td></tr><tr><td>Forbici</td><td>Qualsiasi marca</td><td>N/A</td><td>Per il taglio di code di pesce adulto</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sangon</td><td>A600485</td><td>Per la preparazione</td></tr> <tr><td>del tampone di lisiSpazzole piccole Qualsiasi</td><td>marca</td><td>N/A</td><td>Per spostare delicatamente gli embrioni su piastre per microiniezione</td></tr><tr><td>Spettrofotometro</td><td>Thermofisher</td><td>NanoDrop 2000</td><td>Per misure di concentrazione di DNA/RNA</td></tr><tr><td>Micrometro da palcoscenico</td><td>Qualsiasi marca</td><td>DIV (Divisione) = 0,01 mm</td><td>Per quantificare una goccia da 1 nL</td></tr><tr><td>Microscopio a stereofluorescenza</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td>Per l'osservazione dell'espressione genica</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Motic</td><td>SMZ-168</td><td>Per l'osservazione e la microiniezione</td></tr><tr><td>Sistema di produzione di RNA su larga scala T7 RiboMAX Express</td><td>Promega</td><td>P1320</td><td>Trascrizione in vitro di sgRNA, senza RNasi</td></tr><tr><td>Incubatrice a temperatura controllata</td><td>Qualsiasi marca</td><td>N/A</td><td>Per l'incubazione degli embrioni</td></tr><tr><td>TIDE TIDE</td><td>https://tide.nki.nl/</td><td></td> <td>Per l'analisi dell'efficienza dell'sgRNA&nbsp;</td></tr><tr><td>Tricaina metanosolfonato</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td>Per la preparazione della soluzione di tricaina</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sangon</td><td>A600194</td><td>Per la soluzione di tricaina, il tampone di lisi e la preparazione del tampone TAE</td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>OXOID</td><td>LP0042</td><td>Per le piastre LB</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Qualsiasi marca</td><td>N/A</td><td>Per il taglio degli aghi da iniezione</td></tr><tr><td>XbaI</td><td>NEB</td><td>R0145S</td><td>Per enzimatico digestione</td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>OXOID</td><td>LP0021</td><td>Per piastre LB</td></tr><tr><td>Sistema di acquario per pesci zebra</td><td>ESEN ESEN-AW-S1</td><td></td><td>Per l'allevamento di pesci adulti</td></tr><tr><td>Vasche di accoppiamento per pesci zebra (con divisore)</td><td>Qualsiasi marca</td><td>N/A</td><td>Per l'accoppiamento dei pesci</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 900+Airyscan2</td><td>ZEISS</td><td>Zeiss LSM900</td><td>Per l'imaging confocale dei pesci marcati con fluorescenza e l'analisi dei dati</td></tr><tr><td>ZFIN http://zfin.org/</td><td></td><td></td> <td>Per trovare informazioni sui geni</td></tr></tbody></table>

marcatura a fluorescenza per visualizzare le proteine a bassa espressione nel pesce zebra

Fluorescence Labeling to Visualize Low-Expressed Proteins in Zebrafish

Le giunzioni gap costituite da proteine polimeriche chiamate connessine sono essenziali per lo scambio di metaboliti e ioni a basso peso molecolare tra le cellule in contatto. Il metodo di marcatura delle proteine fluorescenti descritto sopra è stato utilizzato per marcare rispettivamente la connessina 39.9 (Figura 5A) e la connessina 44.1 (Figura 5B). La corretta KI è stata verificata mediante PCR a giunzione (Figura 6</st...

Marcatura a fluorescenza per visualizzare le proteine a bassa espressione nel pesce zebra

CRISPR/Cas9-mediated knock-in (KI) technology allows for easier fluorescent-protein tagging in zebrafish (Danio rerio), a preferred model organism for in ...

fluorescence-labeling-to-visualize-low-expressed-proteins-in-zebrafish

Research

Ricerca

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Montare tutto ibridazione in situ è ​​una delle tecniche più utilizzate in biologia dello sviluppo. Qui, presentiamo una ad alta risoluzione doppio fluorescente in protocollo ibridazione in situ per analizzare il modello preciso espressione di un singolo gene e per determinare la sovrapposizione dei domini di espressione di due geni. Includiamo un propidio ioduro nucleare contro-macchia per evidenziare l'organizzazione dei tessuti.

Zebrafish intero monte ad alta risoluzione doppia fluorescente In Situ Ibridazione

Chiave per comprendere i processi morfogenetici che forma l'embrione precoce è la capacità di celle di immagine ad alta risoluzione. Descriviamo qui una tecnica per l'etichettatura di singole cellule o piccoli gruppi di cellule in embrioni di zebrafish intero con membrana mirati proteina verde fluorescente.

Etichettatura e cellule Imaging nel romboencefalo Zebrafish

Questo protocollo delinea un modo per etichettare e tracciare il destino dei piccoli gruppi di cellule di embrioni di zebrafish con UV-uncaging della fluoresceina in gabbia, seguita da montare tutto immunomarcatura per amplificare il segnale proveniente dal fluoresceina Uncaged.

Etichettatura stirpe di cellule Zebrafish con laser Uncagable Fluoresceina Destrano

Cellule morenti vengono estrusi da tessuti epiteliali dalla contrazione concertata delle cellule vicine senza interrompere la funzione di barriera. L'ottica degli zebrafish di sviluppo, prevede un ottimo sistema per visualizzare estrusione nel vivere epiteli. Qui si descrivono i metodi per indurre ed estrusione immagine nell'epidermide zebrafish larvale a risoluzione cellulare.

Immagini dal vivo di estrusione in cella dal Epidermide di Zebrafish in via di sviluppo

Un metodo è descritto photoactivate singole cellule contenenti una proteina fluorescente in gabbia con assorbimento a due fotoni da un Ti: zaffiro oscillatore laser a femtosecondi. Per mappare il destino della cellula fotoattivati, immunoistochimica è usato. Questa tecnica può essere applicata a qualsiasi tipo di cellula.

Singolo Destino Mapping di celle in Zebrafish

Qui descritto è un protocollo per l'imaging semi-automatica di fluorescenza tessuto-specifica in embrioni di zebrafish.

Imaging semi-automatico di fluorescenza tessuto-specifica in embrioni di zebrafish

L'embrione zebrafish è un ottimo modello per la ricerca biologia dello sviluppo. Durante l'embriogenesi, zebrafish sviluppare con una massa tuorlo, che presenta sfide tridimensionali per l'osservazione e l'analisi del campione. Questo protocollo descrive come creare bidimensionali montaggio preparazioni semplici di tutto il monte in situ (WISH) colorati esemplari embrioni di zebrafish.

Preparazione di montaggio schermo per l&#39;osservazione e l&#39;analisi di zebrafish campioni macchiato da Whole Monte<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione

I livelli di proteine ​​nelle cellule e tessuti sono spesso strettamente regolati dal saldo della produzione di proteine ​​e di liquidazione. Usando fluorescenza Decay Dopo Fotoconversione (FDAP), la cinetica di clearance di proteine ​​possono essere sperimentalmente misurati in vivo.

Misurare Protein Stabilità in Living embrioni di zebrafish Usando fluorescenza Decay Dopo Fotoconversione (FDAP)

L'imaging del comportamento dinamico degli organelli e di altre strutture subcellulari in vivo può far luce sulla loro funzione in condizioni fisiologiche e patologiche. Qui, presentiamo metodi per marcare geneticamente due organelli, centrosomi e mitocondri, e per l'imaging delle loro dinamiche in embrioni di zebrafish viventi utilizzando la microscopia a campo largo e confocale.

Imaging strutture subcellulari nell&#39;embrione Living Zebrafish

Le manipolazioni mirate per causare stress diretto o morte nelle singole cellule sono state relativamente difficili da realizzare. In questo articolo, viene descritto un approccio di ablazione con risoluzione di singole cellule per stressare e uccidere selettivamente singole cellule in coltura cellulare e animali viventi basato su un laser UV confocale standard.

Attivazione delle cellule Lo stress e la morte con i convenzionali UV laser Microscopia confocale

Questo protocollo dimostra l'immunofluorescenza sequenziale e l'immunosofochimica sulle criosezioni degli embrioni di pesce zebra in fase iniziale, consentendo precise analisi di co-localizzazione in specifiche popolazioni cellulari.

Immunofluorescenza sequenziale e immunosofochimica su embrioni di pesce zebra criosezione

Scopri la marcatura a fluorescenza per visualizzare proteine a bassa espressione in Danio rerio. Questo metodo semplifica la costruzione del donatore e migliora l'imaging proteico in vivo.

Marcatura a fluorescenza per visualizzare le proteine a bassa espressione nel pesce zebra

Esplora altri video