Name: Criosezione e immunocolorazione della retina del topo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Impara la criosezione e l'immunocolorazione della retina del topo per studiare i fotorecettori e le malattie retiniche. Questo protocollo garantisce sezioni con morfologia preservata per analisi di alta qualità.

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<ol><li>Tokuyasu, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunochemistry+on+ultrathin+frozen+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+J%22%5BJournal%5D)">Immunochemistry on ultrathin frozen sections.</a> Histochem J. 12 (4), 381-403 (1980).</li>
<li>Ramos-Vara, J. A., Miller, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+tissue+antigens+and+antibodies+get+along%3A+Revisiting+the+technical+aspects+of+immunohistochemistry--the+red%2C+brown%2C+and+blue+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Pathol%22%5BJournal%5D)">When tissue antigens and antibodies get along: Revisiting the technical aspects of immunohistochemistry--the red, brown, and blue technique.</a> Vet Pathol. 51 (1), 42-87 (2014).</li>
<li>Usukura, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cryosectioning+technique+for+the+observation+of+intracellular+structures+and+immunocytochemistry+of+tissues+in+atomic+force+microscopy+%28AFM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A cryosectioning technique for the observation of intracellular structures and immunocytochemistry of tissues in atomic force microscopy (AFM).</a> Sci Rep. 7 (1), 6462(2017).</li>
<li>Park, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+organization+of+rhodopsin+in+rod+photoreceptor+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Supramolecular organization of rhodopsin in rod photoreceptor cell membranes.</a> Pflugers Arch. 473 (9), 1361-1376 (2021).</li>
<li>Boonstra, H., Oosterhuis, J. W., Oosterhuis, A. M., Fleuren, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cervical+tissue+shrinkage+by+formaldehyde+fixation%2C+paraffin+wax+embedding%2C+section+cutting+and+mounting%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Arch+A+Pathol+Anat+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Cervical tissue shrinkage by formaldehyde fixation, paraffin wax embedding, section cutting and mounting.</a> Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol. 402 (2), 195-201 (1983).</li>
<li>Stradleigh, T. W., Ishida, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+strategies+for+retinal+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Fixation strategies for retinal immunohistochemistry.</a> Prog Retin Eye Res. 48, 181-202 (2015).</li>
<li>Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+physical+basics+of+routine+formaldehyde+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Oral+Maxillofac+Pathol%22%5BJournal%5D)">Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation.</a> J Oral Maxillofac Pathol. 16 (3), 400-405 (2012).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+preparation+of+mouse+retinal+cryosections%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Histochem%22%5BJournal%5D)">An improved method for preparation of mouse retinal cryosections.</a> Eur J Histochem. 64 (3), 3154(2020).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quick+protocol+for+the+preparation+of+mouse+retinal+cryosections+for+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biol%22%5BJournal%5D)">A quick protocol for the preparation of mouse retinal cryosections for immunohistochemistry.</a> Open Biol. 11 (7), 210076(2021).</li>
<li>Szel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+topographic+separation+of+two+spectral+classes+of+cones+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Unique topographic separation of two spectral classes of cones in the mouse retina.</a> J Comp Neurol. 325 (3), 327-342 (1992).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>-80 &deg; C congelatore</td><td>Haier</td><td>DW-86L626</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio ad adesione</td><td>CITOTEST</td><td>80312-3161</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488-Capra anti-coniglio</td><td>Proteintech</td><td>SA00006-2</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J topo</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo per criosezione</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Criostato</td><td>LEICA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr>Tecnologia <td>di segnalazione cellulare</td> <td>DAPI</td><td>4083S</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio da dissezione</td><td>ZEISS</td><td>3943030830</td><td></td></tr><tr><td>Siero d'asino</td><td>Solarbio</td><td>S9100</td><td></td></tr><tr><td>Stampi per inclusione</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1841</td><td></td></tr><tr><td>Forbici per dissezione fine</td><td>RWD</td><td>S13001-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinza fine</td><td>RWD</td><td>F11020-11</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio acquoso Fluoromount</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4680</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore</td><td>Shanghai Yuejin</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1049330500</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1048771000</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FIS-06666</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale laser</td><td>ZEISS</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Coperchio del microscopio Vetro</td><td>CITOTEST</td><td>80340-3610</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1065860500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1091371003</td><td></td></tr><tr><td>composto O.C.T</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Pap pen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z672548</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>441244</td><td></td></tr><tr><td>Coniglio anti-PDE6B</td><td>Proteintech</td><td>22063-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td>SCILOGEX</td><td>8042210200</td><td></td></tr><tr><td>Forbici a molla</td><td>RWD</td><td>S11036-08</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>BioFroxx</td><td>1245GR500</td><td></td></tr><tr><td>Super colla</td><td>Deli</td><td>7147S</td><td></td></tr><tr><td>Corda da tennis (1,24 mm)</td><td>Gosen</td><td>TS761</td><td></td></tr><tr><td>Tribromoetanolo</td><td>Macklin</td><td>T831042</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Solarbio</td><td>IT9100</td><td></td></tr></tbody></table>

criosezione e immunocolorazione della retina del topo

Cryosectioning and Immunostaining of Mouse Retina

Seguendo il protocollo sopra descritto, gli occhi di topi C57Bl/6J wild-type di 1 mese sono stati fissati in PFA al 4%. I campioni fissati sono stati quindi incorporati nell'OCT e criosezionati. Le sezioni sono state immunocolorate con un anticorpo anti-PDE6B e controcolorate con DAPI per marcare i nuclei. La PDE6B è una proteina di fototrasduzione specificamente espressa nelle cellule dei fotorecettori dei bastoncelli4. Rispetto ai protocolli tradizionali, questo protocollo migliora significativa...

Criosezione e immunocolorazione della retina del topo

Tissue sectioning and immunohistochemistry are essential techniques in histological and pathological studies of retinal diseases using animal models. ...

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La retina murina neonatale fornisce un modello fisiologico ben caratterizzato dell'angiogenesi, che permette indagini sui ruoli dei geni o farmaci diversi che modulano l'angiogenesi in...

Tutta Monte immunofluorescenza del mouse Retina neonatale per Indagare Angiogenesi<em&gt; In vivo</em

Il metodo immunogold post-inclusione è uno dei modi più efficaci per fornire analisi ad alta risoluzione della localizzazione subcellulare di molecole specifiche. Qui descriviamo un protocollo per analizzare quantitativamente i recettori del glutammato nelle sinapsi del nastro retinico.

Risoluzione alta analisi quantitativa Immunogold di Recettori di membrana a retina nastro Sinapsi

Dimostriamo di tre tecniche di preparazione dei tessuti differenti per la visualizzazione di immunohistochemical di periciti microvascolare del ratto, vale a dire, cryo-sezioni, intero-monta e ipotonico isolamento della rete vascolare.

Cryo-sezioni della retina, intero-monta e ipotonico Vasculature isolato preparazioni per la visualizzazione di Immunohistochemical dei Pericytes microvascolare

Questo rapporto descrive metodi completi per la preparazione di sezioni della retina del topo congelato per l'immunohistochimica (IHC).  I metodi descritti includono la dissezione della coppa posteriore oculare, la fissazione della paraformaldeide, l'incorporamento nei supporti e nell'orientamento dei tessuti della temperatura di taglio ottimale (OCT), il sezionamento e l'immunostaining.

Preparazione delle sezioni ricrello della retina

Qui presentiamo un protocollo per adattare il metodo CLARITY dei tessuti cerebrali per retine a montaggio intero per migliorare la qualità della colorazione immunoistochimica standard e l'imaging ad alta risoluzione dei neuroni retini e delle loro strutture subcellulari.

Immunostaining delle retine a montaggio intero con il metodo clarity tissue clearing

Questo protocollo presenta due tecniche per isolare i compartimenti subcellulari dei fotorecettori murini a bastoncello per l'analisi delle proteine. Il primo metodo utilizza retina viva e carta da filtro di cellulosa per separare i segmenti esterni dell'asta, mentre il secondo impiega retina liofilizzata e nastro adesivo per rimuovere gli strati del segmento interno ed esterno dell'asta.

Due metodi di peeling per l'isolamento dei compartimenti cellulari fotorecettori nella retina del topo per l'analisi delle proteine

Qui è presentato un protocollo immunoistochimico dettagliato per identificare, convalidare e indirizzare le caspasi funzionalmente rilevanti nei tessuti complessi.

Quantificazione della caspasi-9 immunocolorata nel tessuto retinico

Questo protocollo descrive la procedura per isolare la retina di topo a montaggio intero ed eseguire l'immunocolorazione per marcare tutte le cellule gangliari retiniche (RGC). Il processo è seguito dall'imaging e dal conteggio automatico delle RGC utilizzando un software basato sull'intelligenza artificiale, fornendo un metodo semplice, veloce e accurato per quantificare le RGC nell'intera retina del topo.

Immunocolorazione a montaggio intero e conteggio automatico delle cellule gangliari retiniche di topo

I periciti nel sistema vascolare retinico sono stati esaminati mediante colorazione immunofluorescente con β del recettore del fattore di crescita derivato dalle piastrine dopo iniezione retro-orbitale di lectina fluorescente di pomodoro. La retina marcata è stata ulteriormente trattata con il metodo di pulizia dei tessuti e montata per visualizzare le viste tridimensionali dei periciti che circondano il sistema vascolare retinico sotto un microscopio confocale.

Visualizzazione 3D dei periciti vascolari retinici nei topi mediante immunocolorazione 

La retina mostra una complessa organizzazione spaziale attraverso la sua struttura laminare. Le moderne tecniche di trascrittomica spaziale e sequenziamento richiedono sezioni di tessuto &lt; 20 μm di spessore, limitandone l'applicabilità nella ricerca retinica. Questo metodo di criosezione appena congelato produce sottili sezioni en face della retina di topo preservando le relazioni spaziali planari, consentendo una mappatura molecolare completa tra le lamine.

En face Criosezione della retina di topo per analisi molecolare spaziale ad alta dimensione

Impara la criosezione e l'immunocolorazione della retina del topo per studiare i fotorecettori e le malattie retiniche. Questo protocollo garantisce sezioni con morfologia preservata per analisi di alta qualità.

Criosezione e immunocolorazione della retina del topo

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