Name: Analisi dellattività delle cellule T umane in un contesto di co-coltura allogenica di cellule tumorali pretrattate (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-07T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Scopri l'analisi dell'attivazione delle cellule T umane in co-coltura allogenica con cellule tumorali pretrattate mediante radioterapia e inibitori di chinasi. Questo metodo aiuta a comprendere le risposte immunitarie nel contesto della terapia antitumorale.

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</ol>

<table><tbody><tr><td>Provette Cellstar da 15 mL</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Provette Cellstar da 50 mL</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>piastra per coltura cellulare a 6 pozzetti sterile, con coperchio</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>piastra per coltura cellulare a 96 pozzetti sterile, fondo F, con coperchio</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>AZD0156</td><td>Selleck Chemicals GmbH</td><td>S8375</td><td></td></tr><tr><td>Berzosertib (VE-822)</td><td>Selleck Chemicals GmbH</td><td>S7102</td><td></td></tr><tr><td>CASYcups</td><td>OMNI Life Science GmbH & Co KG&nbsp;</td><td></td><td></td>5651794</tr><tr><td>CASYton</td><td>OMNI Life Science GmbH & Co KG&nbsp;</td><td></td><td></td>5651808</tr><tr><td>CD25a, PE-Dazzle594, IgG1 di topo</td><td>Biolegend</td><td>356126</td><td></td></tr><tr><td>CD28-UNLB</td><td>Beckmann Coulter, Inc.</td><td>IM1376</td><td></td></tr><tr><td>CD3a, Krome Orange, mouse IgG1</td><td>Beckmann Coulter, Inc.</td><td>B00068</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale CD3e</td><td>Thermo-Fisher Scientific, Inc.</td><td>MA1-10176</td><td></td></tr><tr><td>CD4, APC, topo anti-umano IgG1</td><td>BD Pharmingen</td><td>555349</td><td></td></tr><tr><td>CD8 MicroBeads, umano</td><td>Miltenyi Biotec, Inc.</td><td>130-045-201</td><td></td></tr><tr><td>CD8a, PerCP-Cy5.5, IgG1 di topo</td><td>Biolegend</td><td>300924</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Colorante rosso intenso</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>C34565</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>&nbsp; Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td><td>21888</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco&acute; s Aquila modificata&acuto; </td><td>PAN-Biotech GmbH</td><td>P04-02500</td><td></td></tr><tr><td>Citometro a flusso DxFlex (con caricatore automatico)</td><td>Beckmann Coulter, Inc.</td><td>C44326, C02846</td><td></td></tr><tr><td>EDTA sale disodico diidrato</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>FBS superior&nbsp;</td><td>&nbsp; Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td><td>S0615-500ML</td><td></td></tr><tr><td>FBS superiore&nbsp;</td><td>&nbsp; Merck KGaA (Sigma-Aldrich)&nbsp;</td><td>S0615-100ML</td><td>Per la produzione di FBS inattivato a caldo. Riscaldare per 30 minuti a 56 gradi C con miscelazione per inattivare le proteine del complemento.</td></tr><tr><td>Graph Pad Prism (numero di versione 9)</td><td>GraphPad</td> <td>Software-HLA-DR</td><td></td></tr><tr><td>, DP, DQ Anticorpo, anti-umano, APC-Vio770</td><td>Miltenyi Biotec, Inc.</td><td>130-123-550</td><td></td></tr><tr><td>Kaluza (numero di versione 2.1)</td><td>Beckmann Coulter, Inc.</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>L-Arginina</td><td>Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td><td>A8094-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-Lisina-monocloridrato</td><td>Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td><td>L5626-100G</td><td></td></tr><tr><td>MACS BSA Soluzione madre</td><td>Miltenyi Biotec, Inc.</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>Colonne MS</td><td>Miltenyi Biotec, Inc.</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Camera di conteggio migliorata Neubauer</td><td>Paul Marienfeld GmbH & Co. KG&nbsp;</td><td>640010</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td><td>D8537-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Thermo-Fisher Scientific, Inc.</td><td>1514-122</td><td></td></tr><tr><td>ROTISep 1077</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>0642.2</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium</td><td>Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td><td>R1790</td><td></td></tr><tr><td>SepMate 50mL provette</td><td>Stemcell Technologies</td><td>85450</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td><td>T6146-25G</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Thermo-Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td>15400054</tr></tbody></table>

analisi dell'attività delle cellule t umane in un contesto di co-coltura allogenica di cellule tumorali pretrattate

Analysis of Human T Cell Activity in an Allogeneic Co-Culture Setting of Pre-Treated Tumor Cells

Le cellule tumorali HSC4 derivate da un HNSCC sono state seminate e incubate durante la notte. Dopo 24 ore, le cellule sono state trattate con un inibitore della chinasi. Dopo 3 ore, sono state applicate le prime due dosi di 5 Gy per frazione. Dopo 24 ore, è stata applicata la seconda dose e le cellule sono state nuovamente incubate durante la notte. Parallelamente, 48 ore prima dell'inizio della co-coltura, le cellule T sono state isolate dal sangue di un donatore sano. In primo luogo, le PBMC sono state isolate utilizzando provette per centrifugazione a gradiente di densità e un mezzo di separazione sterile. Le PBMC sono state contate utilizzando una camera di conteggio delle cellule e le cellule T CD8+ sono state isolate utilizzando il kit di isolamento delle cellule T CD8+. Le cellule T CD8+ isolate sono state quindi colorate con CFSE (1 μM) e successivamente contate. Le cellule T sono state seminate in piastre a pozzetti pre-rivestite CD3/CD28 con una densità di 1,5 x 106 cellule/3 mL. Dopo 48 ore di stimolazione, le cellule T sono state raccolte, contate e risospese in una densità di 10.000 cellule/10 μL. Inoltre, sono stati raccolti e contati pozzetti rappresentativi delle cellule tumorali seminate e il terreno è stato sostituito con tutti i pozzetti rimanenti. Le cellule T sono state aggiunte alle cellule tumorali in un rapporto 1:1. La co-coltura è stata raccolta dopo 96 ore, il surnatante è stato conservato a -20 °C e le cellule sono state colorate e misurate mediante citometria a flusso (Figura 1).
Le cellule T sono state identificate in base all'esclusione dimensionale e alla positività CD3/CD8. Il segnale CFSE delle cellule CD3+/CD8+ positive ha mostrato la distribuzione delle cellule T non proliferative (alto segnale CFSE) e sottopopolazioni distinte di cellule T proliferanti (perdita dell'intensità del segnale CFSE). La proporzione di cellule T proliferanti è stata misurata in modo esemplare per la linea cellulare HSC4 HNSCC (Figura 4A). Tutte le cellule T che mostravano almeno una divisione sono state definite "proliferative". Le cellule T che mostravano più di 3 divisioni sono state definite "altamente proliferative" (Figura 4B). Per la linea cellulare HPV-negativa HSC4, è stato rilevato un leggero aumento del tasso di proliferazione quando le cellule T sono state co-coltivate con cellule tumorali irradiate. L'inibizione di RT e RT plus di ATR ha determinato un aumento significativo della proliferazione consecutiva delle cellule T rispetto alle co-colture di cellule HSC4 trattate con RT più inibizione ATM con cellule T. Per quanto riguarda la frazione "altamente proliferativa" delle cellule T, il pretrattamento delle cellule HSC4 con RT e inibizione di ATR è stato più efficace nello stimolare la proliferazione delle cellule T (Figura 4B).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67643/67643fig04v2.jpg"> 
Figura 4: Proliferazione di cellule T colorate con CFSE per l'analisi delle variazioni dipendenti dal trattamento delle HSC4 nella proliferazione delle cellule T. (A) Proporzione di cellule T proliferanti dopo 96 ore di co-coltura con cellule tumorali HSC4 HPV-negative pretrattate. La proliferazione delle cellule T è risultata significativamente più bassa dopo la co-coltura con cellule tumorali HSC4 trattate con RT+ATMi rispetto al trattamento con RT o RT più ATRi. (B) La RT delle cellule tumorali HSC4 ha indotto una frazione più elevata di cellule T altamente proliferanti (più di tre divisioni cellulari. Dopo la co-coltura di cellule tumorali HSC4 pretrattate RT+ATRi con cellule T, la percentuale di cellule T altamente proliferative era la più alta. Le barre mostrano i dati di quattro esperimenti indipendenti con le cellule T di quattro donatori indipendenti e sani (n = 4; Mean ± SD). (*p≤ 0,05, **p≤ 0,01, ***p≤ 0,001, ****p≤ 0,0001; significatività statistica testata confrontando tutte le condizioni sperimentali con ciascuna di esse utilizzando Mann-Whitney-U a due code per dati non distribuiti normalmente). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67643/67643fig04largev2.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
La perdita di CFSE basata sulla proliferazione può essere utilizzata per quantificare il tasso di proliferazione delle cellule T. Inoltre, diversi marcatori della superficie cellulare sono descritti come associati all'attività delle cellule T, come CD25 e HLADR. Pertanto, è stata eseguita l'analisi di CD25 e HLA-DR sulla superficie di tutte le cellule T CD3+ e CD8+ mediante citometria a flusso (Figura 5). L'espressione può essere quantificata se sono rilevabili sottopopolazioni distintedi CD25 oHLA-DR alte e può essere discriminata mediante gating di queste cellule altamente positive (Figura 3B). Se non sono rilevabili sottopopolazioni distinte, è possibile misurare l'intensità media di fluorescenza (MFI) dell'intera popolazione e quantificare gli spostamenti dell'MFI basati sulle condizioni (Figura 3C).
A titolo esemplificativo, l'espressione identificata dall'MFI di CD25 e HLA-DR è stata analizzata dopo 96 ore di co-coltura con cellule tumorali HSC4 pretrattate (Figura 5). Dopo la co-coltura di cellule T con cellule tumorali HSC4 trattate con RT, l'espressione di CD25 sulle cellule T è risultata fortemente sottoregolata. In particolare, il pretrattamento delle cellule tumorali con solo ATMi ha determinato una significativa riduzione dell'espressione di CD25 rispetto al pretrattamento con ATRi. Nel contesto combinato con RT, anche se RT ha determinato una diminuzione dell'espressione di CD25 sulle cellule T, la combinazione di RT con ATMi ha determinato un aumento dell'espressione di CD25 rispetto a RT più ATRi (Figura 5A). Per quanto riguarda l'espressione di HLA-DR sulle cellule T, la RT ha generalmente portato a una sovraregolazione di HLA-DR, ma ancora una volta, in combinazione con ATMi o ATRi, è stato osservato un comportamento diverso (Figura 5B). Le cellule T co-coltivate con cellule HSC4 che sono state pre-trattate con una combinazione di RT+ATRi hanno aumentato l'espressione di HLA-DR rispetto a RT da solo o RT+ATMi.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67643/67643fig05v2.jpg"> 
Figura 5: Espressione dei marcatori di attivazione CD25 e HLA-DR sulla superficie delle cellule T dopo 96 ore di co-coltura con cellule tumorali HSC4 pretrattate. L'espressione di CD25 e HLA-DR è stata analizzata in base allo spostamento dell'MFI dell'intera popolazione di cellule T. La RT di HSC4 ha determinato una diminuzione dell'espressione di CD25 sulle cellule T e un aumento dell'espressione di HLA-DR. La combinazione di RT con ATMi ha portato a modelli di espressione significativamente diversi rispetto a RT più ATRi. I boxplot mostrano i dati di quattro esperimenti indipendenti con le cellule T di quattro donatori sani indipendenti (n = 4; Mean ± SD). I dati sono stati analizzati confrontando tutte le condizioni sperimentali tra loro utilizzando un test di Mann-Whitney-U a due code per dati non distribuiti normalmente (*p≤ 0,050). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67643/67643fig05largev2.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Questi dati indicano in modo esemplare che il trattamento delle cellule tumorali, in questo caso delle cellule HSC4 HNSCC, influisce sull'immunogenicità delle cellule tumorali. Questo può essere monitorato mediante la co-coltivazione delle cellule tumorali con le cellule T pre-stimolate, il che porta a un comportamento di proliferazione diversificato e all'espressione di marcatori di attivazione sulle cellule T umane in base al regime di trattamento delle cellule tumorali applicato.

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