Analisi dell'attività delle cellule T umane in un contesto di co-coltura allogenica di cellule tumorali pretrattate

Le cellule tumorali modificano il fenotipo immunitario durante la terapia, il che potrebbe influire sull'esito e quindi lo scopo della nostra ricerca è quello di studiare l'interazione tra cellule T e cellule tumorali per creare una migliore comprensione di tali interazioni.

Miglioramento della sensibilità radio, in particolare nei tumori radioresistenti, combinando la radioterapia con gli inibitori delle chinasi. Individuare la risposta al danno del DNA è attualmente una parte centrale dei recenti sviluppi. Modelli tridimensionali di coltura cellulare e modelli di co-coltura sono attualmente affermati nel campo della radiobiologia per aumentare la comparabilità tra dati in vitro e in vivo.

[Narratore] Per iniziare, ottenere cellule tumorali HSC4 in un volume adeguato di terreno D10. Seminare almeno tre pozzetti per condizione, ciascuno contenente 15.000 cellule in 200 microlitri di terreno in piastre da 96 pozzetti. Designare una piastra per il trattamento del campione, compresi i pozzetti per il controllo delle sole cellule tumorali e solo delle cellule T e i pozzetti per la conta delle cellule per ciascun trattamento il giorno della co-coltura. Il secondo giorno, trattare le cellule tumorali con inibitori della chinasi alle concentrazioni richieste. Irradiare una piastra dopo tre o quattro ore e la stessa dopo 24 ore di incubazione con cinque grigi per l'irradiazione ipofrazionata. Per le cellule mononucleate del sangue periferico, o isolamento PBMC, trasferire il sangue misto EDTA raccolto da un donatore sano in due provette da centrifugazione da 50 millilitri. Riempire entrambe le provette da centrifugazione fino a 50 millilitri con PBS e FBS al 2%. Quindi, preparare sei provette da centrifugazione con intarsi in plastica per la separazione in PBMC. Riempire ciascuno con 15 millilitri di gradiente di densità a freddo. Sovrapporre con cura il terreno di gradiente di densità con 12-15 millilitri di sangue diluito. Centrifugare le provette a 1.200 g per 10 minuti senza decelerazione. Dopo la centrifugazione, trasferire il surnatante in quattro nuove provette da centrifugazione da 50 millilitri. Gettare le provette usate. Riempire le nuove provette da centrifugazione fino a 50 millilitri con PBS e FBS al 2% e centrifugare a 120 G per 10 minuti a temperatura ambiente. Eliminare con cautela il surnatante. Risospendere il pellet di cella in un millilitro di PBS contenente il 2% di FBS e combinare i due pellet in un tubo di falco. Riempire nuovamente la provetta da centrifuga a 50 millilitri con PBS contenente il 2% di FBS. Centrifugare le PBMC a 300 g per 10 minuti. Eliminare con cautela il surnatante. Risospendere il pellet di cella in 80 microlitri di MACS più tampone per 10 alla potenza di sette celle. Aggiungere 20 microlitri di microsfere CD8 per 10 alla potenza di sette cellule e mescolare accuratamente pipettando su e giù. Incubare per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione, lavare le cellule con due millilitri di MACS più tampone per 10 alla potenza di sette cellule. Centrifugare la provetta a 300 G per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver scartato il surnatante, risospendere le cellule in 1000 microlitri di MACS più tampone. Inserire due colonne MS nel magnete e posizionare due provette da centrifugazione da 15 millilitri al di sotto. Equilibrare le colonne con 500 microlitri di tampone MACS plus. Quindi caricare un volume uguale della sospensione cellulare nella colonna MS preparata. Sciacquare le colonne con 500 microlitri di tampone MACS plus tre volte. Etichettare le cellule finali raccolte come flow through o CD8 negative e combinarle in un'unica provetta da centrifugazione. Quindi prendi una nuova provetta da centrifugazione da 15 millilitri etichettata con cellule T CD8 positive. Lavare entrambe le colonne contenenti cellule T CD8 positive marcate magneticamente con 1000 microlitri di MACS più tampone ciascuna. Prima di colorare le cellule T, centrifugarle a 300 G per cinque minuti. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1000 microlitri di PBS. Centrifugare nuovamente la sospensione a 300 G per cinque minuti. Dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 2000 microlitri di una soluzione colorante CFSE micromolare. Incubare per 20 minuti a 37 gradi Celsius. Quindi, centrifugare le cellule colorate a 300 G per cinque minuti. Dopo aver lavato le cellule con PBS, risospenderle in terreno di coltura a cellule T. Seminare le cellule nella piastra a sei pozzetti rivestita di CD3 e CD28 e incubare. Il quarto giorno, raccogli le cellule T e rimettile in sospensione nel rispettivo terreno. Aggiungere il numero desiderato di cellule T ai pozzetti delle cellule tumorali in un rapporto di uno a uno dopo aver contato i pozzetti designati. Il settimo giorno, rimuovere la piastra di coltura dall'incubatore per la quantificazione della proliferazione delle cellule T. Dopo aver lavato le cellule, colorarle con gli anticorpi desiderati ed eseguire la citometria a flusso per valutare le cellule T. Escludere la popolazione di doppietti in base all'area di dispersione diretta rispetto all'altezza di dispersione diretta per ottenere singoletto. Tracciare i singoletti per identificare le cellule T in base all'area di dispersione diretta rispetto all'area di dispersione laterale. Tracciare l'espressione di CD3 rispetto all'area di dispersione laterale per discriminare le cellule T. Inoltre, identificare le cellule T CD8 positive dopo aver tracciato il segnale CD8 contro l'area di dispersione laterale. Tutte le cellule T dovrebbero esprimere CD3 e CD8. Traccia il segnale CFSE di tutte le cellule T CD8 positive come istogramma. Dopo aver completato le fasi di gating, selezionare le cellule T CD8 positive come input e analizzare la loro espressione isotipica CD25 o HLA-DR tracciando la rispettiva fluorescenza del marcatore di superficie rispetto all'area di dispersione laterale. La percentuale di cellule T proliferative è aumentata quando sono state co-coltivate con cellule tumorali HSC4 irradiate. La radioterapia o l'inibizione di RT e RT plus di ATR hanno migliorato significativamente la proliferazione delle cellule T rispetto all'inibizione di RT più ATM. Tra le cellule T altamente proliferative, l'inibizione di RT più ATR è risultata la più efficace nello stimolare la proliferazione. L'espressione di CD25 sulle cellule T è risultata downregolata dopo la co-coltura con cellule tumorali HSC4 trattate con RT. Il pretrattamento delle cellule tumorali con il solo inibitore di ATM ha ridotto significativamente l'espressione di CD25 rispetto all'inibitore di ATR. La combinazione di RT e inibitore di ATM ha determinato un aumento dell'espressione di CD25 rispetto a RT più inibitore di ATR. L'espressione di HLA-DR sulle cellule T è stata generalmente sovraregolata da RT. La co-coltura con cellule HSC4 pretrattate con RT più inibitore di ATR ha ulteriormente aumentato l'espressione di HLA-DR rispetto a RT da solo o RT più inibitore di ATM.