Trasduzione retrovirale efficiente e homing competitivo per lo studio della localizzazione delle cellule T mediata da GPCR in diversi microambienti tissutali

La nostra ricerca esplora il modo in cui i GPCR influenzano il traffico e il posizionamento delle cellule immunitarie in vari microambienti tissutali. Utilizzando questo protocollo e altri protocolli complementari, il nostro laboratorio ha identificato un asse chemioattrattivo organo-specifico nei tessuti mucosi non intestinali. Quindi ora abbiamo scoperto come i linfociti, sede dello stomaco, del polmone, della trachea e del tratto gastrointestinale. Sto presentando un metodo efficiente e migliorato per testare come i singoli GPCR influenzano il movimento delle cellule T in vivo. Abbiamo sviluppato un modo affidabile per introdurre questi recettori nelle cellule T, che ora consentono il confronto diretto fianco a fianco in saggi di homing competitivi. Ora che sappiamo come i GPCR guidano le cellule T in vivo, i ricercatori possono collegare meglio l'espressione del recettore alla funzione immunitaria. Ciò aiuterebbe i ricercatori nell'immunologia di base e nella ricerca terapeutica. Con questo approccio, possiamo ora chiederci in che modo i GPCR meno noti o non caratterizzati siano coinvolti nel guidare le cellule T verso tessuti specifici. Possiamo imparare come la segnalazione GPCR potrebbe essere messa a punto per trattare il cancro o l'autoimmunità. Possiamo aiutare le cellule T a raggiungere il posto giusto al momento giusto per gli approcci terapeutici.

[Narratore] Per iniziare, il primo giorno, rivestire piastre di coltura tissutale da 10 centimetri con cinque millilitri di soluzione di poli-D-lisina da 50 microgrammi per millilitro preparata in acqua sterile. Incubare le piastre a temperatura ambiente per 45 minuti, quindi lavare le piastre due volte con PBS sterile senza calcio e magnesio per garantire che non rimangano residui. Successivamente, staccare le cellule Plat-E utilizzando due millilitri di tripsina allo 0,05% e EDTA 0,5 millimolari a 37 gradi Celsius per tre minuti. Per garantire la vitalità cellulare utilizzando il saggio di esclusione del blu di tripano, miscelare un volume uguale della sospensione cellulare con la soluzione di blu di tripano. Quindi, seminare 3 milioni di cellule vive in una piastra di Petri per colture tissutali di 10 centimetri con terreno Plat-E privo di antibiotici. Il secondo giorno, sostituire il terreno su colture cellulari Plat-E con 6,5 millilitri di terreno a siero ridotto. Preparare la miscela di trasfezione secondo le istruzioni del produttore. Per ogni piastra, mescolare 45 microlitri di Lipofectamine 2000 con 210 microlitri di terreno a siero ridotto in un tubo e 15 microgrammi di DNA con 235 microlitri di terreno a siero ridotto in un altro tubo. Combinare il contenuto delle provette pipettando tre o quattro volte e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente per facilitare la formazione di complessi. Ora, aggiungi la miscela goccia a goccia alle piastre e incuba per 16 ore a 37 gradi Celsius. Successivamente, rivestire le piastre a 24 pozzetti per l'attivazione delle cellule T con CD28 e CD3 anti-topo in 375 microlitri per pozzetto di PBS. Incubare le piastre per una notte a quattro gradi Celsius o per tre o quattro ore in un'incubatrice impostata a quattro gradi Celsius. Il terzo giorno, utilizzare uno stantuffo a siringa per schiacciare delicatamente le milze isolate dei topi su un colino cellulare a rete di nylon da 100 micrometri posizionato in una piastra a sei pozzetti contenente terreno RPMI. Trasferire la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare a rete di nylon da 40 micrometri in un tubo conico da 50 millilitri per ottenere una sospensione a cella singola. Centrifugare la soluzione a 450 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Quindi lavare le cellule con PBS senza calcio e magnesio. Quindi, eseguire la selezione magnetica negativa utilizzando il kit di isolamento CD4 delle cellule T del mouse secondo le istruzioni del produttore. Contare la cellula T isolata utilizzando un contatore di cellule. Piastra le cellule T nei pozzetti di attivazione delle cellule T rivestite a una densità da uno a 1,5 milioni di cellule per pozzetto in un millilitro di terreno RPMI 10. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica in un incubatore umidificato per 24-48 ore. Il quarto giorno, raccogliere circa 12 millilitri di surnatante virale dalle piastre da 10 centimetri in un tubo conico. Sostituire il terreno nelle piastre di coltura Plat-E con 10 millilitri di terreno Plat-E privo di antibiotici per generare più surnatante virale per una seconda trasduzione il giorno successivo. Per filtrare il surnatante virale raccolto, passarlo attraverso un filtro a siringa da 0,45 micrometri. Aggiungere otto microgrammi per millilitro di polibrene e da una a 100 diluizioni di tampone HEPES al surnatante filtrato. Centrifugare la piastra di cellule T a 24 pozzetti per sette minuti a 950 g. Quindi, raccogli e conserva con cura il surnatante senza rimuovere le cellule T. Per eseguire la spinfezione, aggiungere un millilitro di surnatante virale a ciascun pozzetto. Sigillare le piastre con pellicola trasparente e centrifugare le piastre a 1.150 g per quattro ore a 32 gradi Celsius. Dopo la parrucchiera, sostituire con cura il terreno in ciascun pozzetto con il surnatante delle cellule T precedentemente conservato. Il sesto giorno, raccogliere le cellule T dalla piastra in una provetta conica e centrifugare. Lavare il pellet con PBS contenente calcio e magnesio. Trasferire le cellule in una nuova piastra di coltura contenente 130 unità per millilitro di interleuchina-2 di topo e 10 nanogrammi per millilitro di interleuchina-7 di topo. Incubare le cellule per almeno due giorni o fino a quando non raggiungono il livello di espansione desiderato in base al numero di cellule necessarie per l'iniezione. L'ottavo giorno, centrifugare a 450 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius per pellettare le cellule. Aggiungere cinque millilitri di Histopaque-1077 in un tubo da 15 millilitri. Risospendere il pellet di cellule T in cinque millilitri di PBS contenente calcio e magnesio. Sovrapporre con cura la sospensione cellulare sopra cinque millilitri di Histopaque-1077 nella provetta da centrifuga. Centrifugare il campione a una temperatura compresa tra 400 e 500 g per 20 minuti a temperatura ambiente, assicurandosi che l'interruzione o l'accelerazione della centrifuga sia impostata su 0. Dopo la centrifugazione, osservare la formazione di strati cellulari distinti. Raccogliere con cura lo strato di interfaccia contenente le cellule desiderate utilizzando una pipetta, evitando la contaminazione con altri strati. Le cellule T trasdotte GPR25 hanno mostrato una maggiore migrazione verso hCXCL17 e mCXCL17 rispetto ai controlli trasdotti da stuffer, convalidando l'espressione del recettore funzionale. GPR25 ha trasdotto cellule localizzate preferenzialmente nei tessuti mucosi non intestinali, come il tratto genito-urinario, lo stomaco e la trachea, con un arricchimento significativo osservato a sette settimane, ma non a una settimana dopo l'iniezione. I saggi di homing a breve termine hanno mostrato che GPR25 trasduceva le cellule T preferenzialmente ospitate negli organi ricchi di Cxcl17, come la trachea, lo stomaco, la lingua, la cistifellea e la mucosa uterina, mentre non riusciva ad accumularsi nei topi carenti di Cxcl17. Le cellule trasdotte da GPR25 sono localizzate prevalentemente nei bronchi, mentre le cellule di controllo sono state trovate più frequentemente vicino alle vene.