Name: Un metodo per 2-Photon Imaging del flusso sanguigno nella neocorteccia attraverso una finestra del cranio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-02-25T14:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Scopri l'imaging del flusso sanguigno nella neocorteccia di topi vivi con microscopia a due fotoni attraverso una finestra cranica. Questa tecnica utilizza destrani fluorescenti per visualizzare la vascolarizzazione cerebrale in vivo.

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Vena iniezioni coda di coloranti fluorescenti destrani <ol><li> Al fine di vascolarizzazione cerebrale immagine, gli animali devono essere iniettato per via endovenosa con un colorante fluorescente. Noi usiamo destrano coniugato coloranti perché la frazione destrano impedisce la tintura di attraversare la barriera ematoencefalica e la fuoriuscita dei vasi sanguigni. </li><li> I topi vengono anestetizzati con isoflurano (4% per l&#39;induzione, 1,5-2% durante l&#39;iniezione). </li><li> Coda è disinfettata con alcool al 70%. </li><li> Con un ago 26 gauge, 75-100 ml di un 5% v / v soluzione di rodamina destrano sciolto in soluzione salina viene iniettata attraverso la vena della coda, a metà strada lungo il fusto della coda. </li><li> Gli animali possono essere ripreso immediatamente dopo l&#39;iniezione fino a quando la coda vena colorante è escreto nelle urine, che si tingono di rosa se si utilizza un colorante rodamina in circa 2 ore. </li></ol> Imaging del flusso di sangue usando la microscopia a due fotoni (durata totale di 30-60 minuti per sessione, a seconda del numero di navi ripreso) <ol><li> Dopo l&#39;iniezione di destrano colorante fluorescente, il mouse è anestetizzato con isoflurano (4% per l&#39;induzione, 1-1,5% per l&#39;imaging). </li><li> Mouse è saldamente utilizzando la barra di titanio allo stadio microscopio, che contiene un termoregolato pad riscaldamento per mantenere l&#39;animale caldo. Alcuni unguento oculare viene applicato a tenere gli occhi umidi. </li><li> La copertura in vetro della finestra cranica è pulito con alcool al 70%. </li><li> La finestra è posizionato parallelo al piano focale e centrato nel campo visivo nel quadro dell&#39;obiettivo di 4X. </li><li> E &#39;meglio prendere una fotografia di navi di superficie del cervello con una fotocamera digitale. Questa immagine sarà utilizzata come immagine di riferimento nel seguire le sessioni di imaging per trovare la regione ripreso più volte da un giorno all&#39;altro. </li><li> L&#39;obiettivo 4X è sostituito con l&#39;obiettivo 40X immersione in acqua senza spostare il palco. Una foto digitale del campo visivo è ripreso. Le coordinate del manipolatore stadio sono fissati a zero. </li><li> Noi usiamo scanimage come il software di acquisizione immagini. Questo è stato scritto in MatLab da Tom Pologruto e Bernardo Sabatini nel laboratorio di Karel Svoboda (Pologruto et al., 2003). Abbiamo poi accendere tutte le altre apparecchiature: il laser, il misuratore di potenza, i tubi moltiplicatori foto, gli amplificatori, ecc </li><li> L&#39;area della finestra adatte ad essere ripreso è brevemente scansione a basso ingrandimento per trovare la migliore regioni. Una volta che questi vengono identificati, uno stack basso ingrandimento della regione scelta per l&#39;immagine è presa, e le sue coordinate XY sono annotati. </li><li> Per registrare la dinamica del flusso di sangue nei piccoli vasi o capillari usiamo scansioni linea lungo almeno 40 micron della nave di interesse. Queste singolo &quot;spazza&quot; della durata di un secondo sono fatto usando come potenza del laser meno possibile e le coordinate e l&#39;angolo di scansione sono scritte. </li><li> Una volta che la sessione di imaging è finita, l&#39;animale viene spostato in una camera calda dove si può recuperare l&#39;anestesia. </li></ol>

<ol><li>Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proc Nat Acad Sci. 95, 15741-15746 (1998).</li>
<li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScanImage%3A+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Eng.+Online%22%5BJournal%5D)">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomed. Eng. Online. 17, 2-13 (2003).</li>
<li>Zhang, S., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+impact+of+cortical+microcirculation+on+synaptic+structure+and+sensory-evoked+hemodynamic+responses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Imaging the impact of cortical microcirculation on synaptic structure and sensory-evoked hemodynamic responses in vivo.</a> 5, (2007).</li>
<li>Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penetrating+arterioles+are+a+bottleneck+in+the+perfusion+of+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex.</a> Proc Nat Acad Sci. 104, 365-370 (2007).</li>
</ol>

Corticale dinamiche di flusso di sangue possono essere studiati in vivo attraverso l&#39;immagine fluorescente coloranti destrano iniettato nella vena della coda di roditori con la microscopia a due fotoni. Questo video ha mostrato un metodo per come la dinamica del flusso ematico immagine in neocorteccia di topi attraverso un vetro coperto di preparazione finestra cranica.

<table><tbody><tr><td>Destrano isotiocianato di fluoresceina</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD500S</td><td>peso mol 500.000</td></tr><tr><td>Destrano isotiocianato di rodamina B</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R9379</td><td>peso mol ~70.000</td></tr></tbody></table>

un metodo per 2-photon imaging del flusso sanguigno nella neocorteccia attraverso una finestra del cranio

A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window

La possibilità di immagine del sistema vascolare cerebrale (da grandi recipienti di capillari) e registrare la dinamica del flusso sanguigno nel cervello dei roditori che vivono intatto è una tecnica potente. Utilizzando in vivo 2-fotone microscopia attraverso una finestra del cranio è possibile coloranti fluorescenti immagine iniettato per via endovenosa. Questo permette uno per l&#39;immagine della vascolarizzazione corticale e anche per ottenere misurazioni del flusso sanguigno. Questa tecnica è stata originariamente sviluppata da David Kleinfeld e Winfried Denk. Il metodo può essere utilizzato per studiare la dinamica del flusso di sangue durante o dopo l&#39;ischemia cerebrale, nei disordini neurodegenerative, in tumori cerebrali, o in fisiologia cerebrale normale. Per esempio, è stato utilizzato per studiare come ictus provoca cambiamenti nella direzione del flusso sanguigno e cambiamenti nella velocità dei globuli rossi o di flusso all&#39;interno e intorno l&#39;infarto. Qui mostriamo come utilizzare 2-fotone microscopia a dinamiche immagine del flusso sanguigno nella corteccia di topi vivi con coloranti fluorescenti iniettato nella vena della coda.

Corticale dinamiche di flusso di sangue possono essere studiati in vivo attraverso l&#39;immagine fluorescente coloranti destrano iniettato nella vena della coda di roditori con 2-fotone microscopia. Questo video mostra come la dinamica del flusso ematico immagine in neocorteccia di topi attraverso un vetro coperto di preparazione finestra cranica.

Un metodo per 2-Photon Imaging del flusso sanguigno nella neocorteccia attraverso una finestra del cranio

La capacità di visualizzare il sistema vascolare cerebrale (dai vasi di grande calibro ai capillari) e di registrare la dinamica del flusso sanguigno nel cervello intatto di roditori viventi è...

La capacità di ottenere immagini della vascolarizzazione cerebrale e registrare la dinamica del flusso sanguigno nel cervello intatto di roditori vivi è una tecnica potente che può essere applicata allo studio dell'ischemia cerebrale o della fisiologia cerebrale normale. Qui dimostreremo come utilizzare due tecniche di microscopia ottica per visualizzare la dinamica del flusso sanguigno nella neocorteccia di topi vivi, impiegando coloranti fluorescenti iniettati nella vena della coda. Questa tecnica è stata originariamente sviluppata da David Kleinfeld a Winfred Dank.Ciao, sono Ricardo Mota del Laboratorio di Carlos Porter Cayo del Dipartimento di Neurologia dell'Università della California di Los Angeles. In un video precedente, vi abbiamo mostrato il metodo per l'implantazione di una finestra cranica per esperimenti di imaging cronico in vivo. Oggi vi mostreremo la procedura per l'acquisizione delle dinamiche del flusso sanguigno nella corteccia cerebrale attraverso una finestra cranica.Questa preparazione è molto utile perché consente di ottenere immagini in profondità all'interno del cervello mediante microscopia laser a due fotoni. Cominciamo dunque. Per visualizzare la vascol

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Questo video e protocollo dimostrano come impiantare una copertura in vetro finestra cranica nei roditori. Queste preparazioni possono essere utilizzate per cronica in vivo a due fotoni di imaging della neocorteccia su scale temporali di mesi. Può essere utilizzato anche per altri tipi di imaging, tra cui l'imaging ottico del segnale intrinseco.

Un Chirurgia Procedura Craniotomia per l&#39;imaging cerebrale cronica

In questo materiale video e supplementare, mostriamo un protocollo per la...

Imaging cronica di mouse corteccia visiva Utilizzando un Assottigliato-teschio di preparazione

Presentiamo un metodo per formare una finestra di imaging nel cranio topo che si estende millimetri ed è stabile per mesi senza infiammazione cerebrale. Questo metodo è adatto per studi longitudinali di flusso sanguigno, dinamica cellulare, e cellule / struttura vascolare con microscopia a due fotoni.

Un lucido e rinforzato Assottigliato cranio-Window a lungo termine Imaging del cervello di topo

Fonte: Bisht, K., et al. Mappatura precisa del cervello per eseguire l'imaging ripetitivo in vivo delle dinamiche neuro-immunitarie nei topi. J. Vis. Exp. (2020)Questo video dimostra l'imaging a fluorescenza delle dinamiche neuroimmunitarie in un topo transgenico con un impianto cranico. La stabilità vascolare e neuronale viene rilevata insieme ai cambiamenti dinamici della microglia, riflettendo le risposte immunitarie all'attività neuronale.

Imaging a fluorescenza delle dinamiche neuroimmunitarie utilizzando un impianto cranico

Un metodo è descritto per l'etichettatura di neuroni con coloranti fluorescenti in predeterminate funzionali micro-domini della neocorteccia. Primo, imaging segnale intrinseco ottico viene utilizzato per ottenere una mappa funzionale. Poi microscopia a due fotoni è usato per l'etichetta e neuroni di immagine all'interno di un micro-dominio della mappa.

Etichettatura mirata di neuroni in una specifica funzionale Micro-dominio della neocorteccia combinando segnale intrinseca e due fotoni Imaging

Cambiamenti molecolari esperienza-dipendenti nei neuroni sono essenziali per la capacità del cervello di adattarsi in risposta alle sfide comportamentali.

In Vivo a due fotoni di imaging dei cambi molecolari esperienza-dipendenti nei neuroni corticali

Descriviamo una procedura sperimentale per la misura di attività neuronale attraverso finestre ottiche dual sopra bilaterale corticies somatosensoriale primaria (S1) in Thy1-GCaMP6s topi transgenici utilizzando 2 fotoni (2P) microscopia in vivo.

Imaging di attività neurale nella corteccia somatosensoriale primaria utilizzando Thy1-topi transgenici GCaMP6s

Presentiamo un in vivo imaging protocol per la corteccia cerebrale di topi neonatali di imaging due fotoni. Questo metodo è adatto per analizzare la dinamica dello sviluppo dei neuroni corticali, i meccanismi molecolari che controllano le dinamiche neuronali e i cambiamenti nella dinamica neuronale in modelli di malattia.

In Vivo Due-fotone Imaging dei neuroni corticali in topi neonatali

Questo studio dimostra la somministrazione di una lesione cerebrale traumatica ripetitiva ai topi e l'impianto simultaneo di una finestra cranica per il successivo imaging intravitale di un EGFP espresso da neuroni utilizzando la microscopia a due fotoni.

Imaging intravitale dell'espressione di proteine fluorescenti nei topi con una lesione cerebrale traumatica a cranio chiuso e una finestra cranica utilizzando un microscopio a due fotoni

Presentiamo un nuovo approccio per la microscopia a due fotoni della somministrazione tumorale di nanoparticelle di ossido di ferro marcate con fluorescenza al glioblastoma in un modello murino.

Microscopia intravitale a due fotoni del glioblastoma in un modello murino

Scopri l'imaging del flusso sanguigno nella neocorteccia di topi vivi con microscopia a due fotoni attraverso una finestra cranica. Questa tecnica utilizza destrani fluorescenti per visualizzare la vascolarizzazione cerebrale in vivo.

Un metodo per 2-Photon Imaging del flusso sanguigno nella neocorteccia attraverso una finestra del cranio

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