Un metodo per 2-Photon Imaging del flusso sanguigno nella neocorteccia attraverso una finestra del cranio

La capacità di visualizzare la vascolarizzazione cerebrale e registrare le dinamiche del flusso sanguigno nel cervello intatto dei roditori viventi è una tecnica potente che può essere applicata allo studio dell'ischemia cerebrale o della normale fisiologia cerebrale. Qui dimostreremo come utilizzare due fotomicroscopia per visualizzare la dinamica del flusso sanguigno nella neocorteccia di topi viventi utilizzando coloranti fluorescenti iniettati nella vena della coda. Questa tecnica è stata originariamente sviluppata da David Kleinfeld in Winfred Dank.

Ciao, sono Ricardo Mota del Laboratorio di Carlos Porter Cayo nel Dipartimento di Neurologia dell'Università della California di Los Angeles. In un video precedente, vi abbiamo mostrato il metodo per impiantare una finestra cranica per esperimenti di imaging cronico in vivo. Oggi vi mostreremo la procedura per l'imaging della dinamica del flusso sanguigno nella corteccia cerebrale attraverso una finestra cranica.

Questa preparazione è molto utile perché consente di visualizzare in profondità all'interno del cervello utilizzando la microscopia laser a fotoni. Quindi iniziamo. Per visualizzare il sistema vascolare cerebrale, gli animali devono essere iniettati per via endovenosa con un colorante fluorescente.

Usiamo coloranti coniugati Dexter perché la moty destranica impedisce al colorante di attraversare la barriera emato-encefalica e di fuoriuscire dai vasi sanguigni. I topi sono anestetizzati con fluoro, il 4% per l'induzione e dall'1,5 al 2% durante l'iniezione. Successivamente, la coda viene disinfettata con tre tamponi di alcol al 70% con un ago calibro 26, da 75 a cento microlitri di una soluzione al 5% di R domino destrano disciolto in soluzione salina viene iniettato attraverso la vena della coda.

A metà dell'asta della coda gli animali possono essere visualizzati immediatamente dopo l'iniezione della vena caudale fino a quando il die non viene escreto nelle urine, che diventerà rosa se si utilizza il colorante domina ERO In circa due ore dopo l'iniezione del colorante Dexter fluorescente, il topo viene anestetizzato con fluoro. Ancora una volta, il 4% per l'induzione, da uno all'1,5% per l'imaging. Il mouse è fissato saldamente utilizzando la barra di titanio al tavolino del microscopio, che contiene un cuscinetto riscaldante termoregolato per mantenere l'animale al caldo.

Viene applicato un po' di unguento per gli occhi per mantenere gli occhi umidi. Il vetro di copertura della finestra cranica viene pulito con alcool al 70%. La finestra è posizionata parallelamente al piano focale e centrata nel campo visivo.

Con l'obiettivo quattro x, è meglio scattare una fotografia dei vasi della superficie del cervello con una fotocamera digitale. Questa immagine verrà utilizzata come immagine di riferimento nelle successive sessioni di imaging per trovare la regione dell'immagine ripetutamente da un giorno all'altro. L'obiettivo quattro x viene quindi sostituito con un obiettivo 40 x ad immersione in acqua.

Senza spostare il palco, viene scattata la foto digitale della vista. Anche in questo caso, le coordinate del manipolatore di fase sono impostate su zero. Utilizziamo la scansione dell'immagine come software di acquisizione delle immagini.

Questo è stato scritto in MATLAB da Tom Paul Rudo e Bernardo Sabatini nel laboratorio di Carls Voto. Successivamente accendiamo tutte le altre apparecchiature, il laser, il misuratore di potenza, i tubi fotomoltiplicatori, gli amplificatori, eccetera. L'area della finestra adatta per l'imaging viene scansionata brevemente a basso ingrandimento per trovare le regioni migliori.

Una volta identificati, viene scattata la pila a basso ingrandimento della regione scelta per l'immagine e le sue coordinate XY vengono annotate per registrare la dinamica del flusso sanguigno in piccoli vasi o capillari. Utilizziamo scansioni lineari lungo almeno 40 micron dell'imbarcazione di interesse. Queste singole scansioni della durata di un secondo vengono eseguite utilizzando la minor potenza laser possibile e le coordinate e l'angolo di scansione vengono annotati.

Una volta terminata la sessione di imaging, l'animale viene spostato in una camera calda dove può riprendersi dall'anestesia. Qui mostriamo una pila di un centinaio di immagini scattate ogni cinque micron con il nostro microscopio a due fotoni attraverso una finestra cranica posta sopra la corteccia somatosensoriale di un topo di cinque mesi a cui è stato iniettato il destrano Domine attraverso la vena caudale. Questa sequenza di immagini mostra la complessa rete di vasi sanguigni grandi e piccoli, compresi i capillari.

Vi abbiamo appena mostrato un metodo per la visualizzazione della dinamica del flusso sanguigno in vivo attraverso una finestra cranica. Questo è un metodo estremamente potente per l'imaging della dinamica del flusso sanguigno cerebrale nel sistema vascolare corticale, ad esempio, per studiare le alterazioni del flusso sanguigno dopo l'ictus. È possibile eseguire più immaginazioni in vari momenti nei BUL utilizzando iniezioni ripetute del colorante fluorescente nella vena caudale.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordarsi di lavorare nelle condizioni più pulite e sterili possibili e di avere una mano molto ferma. Va bene, e questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con il tuo esperimento.