Dosaggio del numero più probabile modificato per quantificare la salmonella nei prodotti a base di pollo crudo e pronto da cuocere

La nostra ricerca sviluppa tecnologie rapide di rilevamento, quantificazione e caratterizzazione di agenti patogeni di origine alimentare, concentrandosi su metodi sensibili che possono migliorare la sicurezza alimentare identificando una contaminazione in contesti reali. Le sfide principali includono il rilevamento rapido e sensibile e matrici complesse con soluzioni a basso costo ma scalabili. Affrontiamo anche le difficoltà nella riduzione dei falsi positivi e nel miglioramento della compatibilità con diversi ambienti di test.

Per la sicurezza alimentare, ciò significa rilevare con precisione gli agenti patogeni a basse concentrazioni in una varietà di matrici alimentari. Il nostro protocollo affronta il divario tra il rilevamento della prevalenza e la quantificazione della salmonella per fornire valori deterministici per il livello di contaminazione nei prodotti alimentari. Il processo è minimamente dirompente in quanto incorpora saggi convalidati utilizzati nei protocolli FSIS e abbastanza flessibile da accogliere ulteriori agenti patogeni e matrici alimentari.

Per iniziare, posiziona il pollo macinato acquistato dal reparto carne fresca dei rivenditori locali su una piattaforma di lavoro. Dividere asetticamente la carne in campioni da 25 grammi. Acquistate i prodotti a base di pollo pronti da cuocere dal reparto surgelati dei rivenditori locali e divideteli in modo asettico in campioni da 25 grammi.

Sierotipo Typhurium ATCC 14028 su una coclea per infusione cardiaca cerebrale. Incubare la piastra per una notte a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, inoculare 25 millilitri di brodo per infusione di cuore cerebrale con una colonia di salmonella appena coltivata.

Coltivare aerobicamente la coltura durante la notte a 37 gradi Celsius con agitazione a 100 giri/min. Per preparare una serie di diluizioni decuplicate, trasferire 0,5 millilitri di coltura in 4,5 millilitri di acqua peptidica tamponata o BPW e mescolare accuratamente. Quindi trasferire 0,5 millilitri dalla diluizione preparata in 4,5 millilitri di BPW per ogni diluizione successiva.

Successivamente, trasferisci asetticamente 25 grammi di pollo macinato irradiato in sacchetti sterili per lo stomaco. Inoculare il campione con un millilitro della concentrazione desiderata della diluizione della coltura. Utilizzando un divaricatore di cellule sterile, distribuire delicatamente l'inoculo in modo uniforme sulla superficie del pollo e lasciarlo riposare a quattro gradi Celsius per un'ora.

Dopo aver incubato per un'ora campioni di pollo macinato irradiati con coltura di salmonella, aggiungere 225 millilitri di BPW a ciascun campione per ottenere il rapporto campione/media desiderato. Omogeneizzare i campioni di pollo utilizzando lo stomacher a velocità normale per 120 secondi. Utilizzando una pipetta da 50 millilitri, rimuovere con cura il liquido dal lato filtrato dello stomacher e dividerlo in due flaconi da centrifuga sterili.

Centrifugare i campioni a 10.000 G per 10 minuti ed eliminare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in tre millilitri di BPW utilizzando una spatola sterile. Aggiungere 12 millilitri di BPW al pellet risospeso e mescolare accuratamente mescolando con una spatola sterile.

Unire il contenuto di entrambi i flaconi da centrifuga in un unico flacone. Aggiungere tre millilitri del campione risospeso a ciascun pozzetto nella colonna uno del blocco di 48 pozzetti per creare otto repliche. Per preparare una serie di diluizioni decuplicate tra le colonne da uno a sei utilizzando una pipetta a otto canali, aggiungere 0,3 millilitri di campione da ciascun pozzetto a 2,7 millilitri di BPW nella colonna successiva, assicurando una miscelazione accurata.

Incubare i blocchi durante la notte a 37 gradi Celsius con agitazione a 100 giri/min. Il giorno successivo, utilizzando una pipetta multicanale, piastrate sette microlitri di coltura da ciascuna diluizione sulle piastre della coclea per infusione cardiaca cerebrale in una griglia quattro per sei. Lasciare asciugare le piastre per 10 minuti prima di incubarle a 37 gradi Celsius per 18-24 ore.

Dopo l'incubazione, esaminare le piastre della coclea, contrassegnando almeno una colonia come positiva e nessuna crescita come negativa. Immettere il numero di diluizione e il fattore di diluizione in un foglio di lavoro. Immettere il volume o il peso appropriato del campione.

Quindi specificare il numero di repliche e inserire il numero di campioni risultati positivi. Fare clic su calcola risultati per analizzare i risultati positivi e negativi annotati utilizzando il semplice metodo di risoluzione della massima probabilità. Per iniziare, allestire il blocco MPN a 48 pozzetti per la coltura della salmonella inoculata con campioni di pollo.

Mescolare le colture in un blocco di 48 pozzetti pipettando su e giù più volte. Trasferire 200 microlitri di ciascuna coltura in una piastra PCR a 96 pozzetti. Sigillare la piastra e centrifugare a 6,600 G per 10 minuti.

Rimuovere il surnatante e aggiungere 20 microlitri del reagente del kit di estrazione del DNA al pellet. Miscelare il pellet pipettandolo su e giù. Ancora una volta, sigillare il piatto e scaldarlo a 99 gradi Celsius per 10 minuti, quindi raffreddarlo a 20 gradi Celsius.

Dopo la centrifugazione, utilizzare due microlitri di surnatante per preparare la miscela QPCR secondo il protocollo stabilito. Utilizzando le seguenti condizioni, eseguire la PCR in tempo reale. Dopo la PCR, esportare i risultati e considerare i pozzetti con valori di soglia del ciclo inferiori o uguali a 30 come positivi e maggiori di 30 come negativi.

Mescolare le colture in un blocco di 48 pozzetti pipettando su e giù più volte. Trasferire 20 microlitri di ciascun campione nel kit per la rilevazione molecolare della salmonella fornito con la provetta di lisi. Riscaldare i campioni a 100 gradi Celsius per 15 minuti.

Quindi incubare i campioni per 10 minuti a temperatura ambiente. Trasferire 20 microlitri di lisato da ciascuna provetta di lisi in una provetta reattiva e caricare le provette reattive nel supporto. Aggiungere il supporto con le provette reagenti allo strumento del sistema di rilevamento molecolare.

Configurare le impostazioni del software per il test del sistema di rilevamento molecolare. Eseguire il test ed esportare il report per l'analisi. Il report MDS Run fornisce informazioni dettagliate sull'output, positive o negative.