Coltivazione e prelievo monoclonale microbico automatizzato e ad alto rendimento con il sistema omico di coltura a microlitri di goccioline a cellula singola

Questa ricerca esplora l'omica della coltura microbica, utilizzando una piattaforma automatica, per migliorare l'isolamento microbico, la coltivazione e lo screening monoclonale. L'obiettivo è quello di migliorare la comprensione dell'intestino umano, del microbioma e delle loro applicazioni. I tecnologi che fanno progredire la ricerca sul microbioma includono la microfluidica, l'isolamento automatico dei ceppi e le piattaforme di screening, gli algoritmi di apprendimento automatico e i dispenser monoclonali per l'analisi delle colture omiche e del microbioma ad alta tensione.

Il sistema a cellule medie migliora significativamente la microview, l'isolamento monoclonale e la colorazione, generando quasi il doppio del numero di cloni rispetto ai metodi tradizionali, migliorando così la capacità di ricerca nel mix di colture intestinali con microview. Questo protocollo risponde all'esigenza di una piattaforma di screening microbico a basso costo e ad alto supporto, superando i limiti dei metodi tradizionali in termini di efficienza e capacità di punteggio per la ricerca sul mix di colture. Il nostro laboratorio si concentrerà ulteriormente sull'integrazione di ulteriori tecniche di manipolazione delle goccioline, come la scissione e la fusione delle goccioline, per espandere la portata delle applicazioni tecnologiche.

Per iniziare, apri lo sportello della camera di generazione e coltivazione delle goccioline della cella MISS. Rimuovere verticalmente il coperchio protettivo per il micro-tubo e il chip microfluidico per la generazione di goccioline. Utilizzando una siringa monouso, aggiungere 10 millilitri di acqua distillata sterile all'umidificatore all'interno della camera e reinstallare il coperchio protettivo.

Aprire la confezione sterile del microtubo e del chip microfluidico per la generazione di goccioline e posizionarlo verticalmente direttamente sopra la camera di coltivazione. Quindi, sull'interfaccia del software, fare clic su Installazione. Quando viene visualizzata la finestra popup di conferma, fare clic su Sì per avviare l'installazione.

Estrarre il dispositivo di rimozione delle bolle d'aria e fissarlo a testa in giù sul posizionamento del dispositivo di rimozione delle bolle d'aria nella camera. Fissare il tubo di uscita delle gocce del dispositivo di rimozione delle bolle d'aria al clampvalvola sottostante. Guidarlo attraverso l'intero percorso che porta alla camera di rilevamento e raccolta delle goccioline.

Dopo aver aperto lo sportello della camera, inserire verticalmente il tubo di rilevamento nella presa di rilevamento. Assicurarsi che il tubo di rilevamento sia completamente inserito. Serrare la vite che fissa il tubo di rilevamento in senso orario.

Dopo aver confermato l'inserimento completo e il fissaggio, chiudere lo sportello della camera. Collegare ciascuno dei 10 tubi in silicone del chip microfluidico, etichettati da L1 a L10, alle corrispondenti valvole a morsetto numerate. Quindi, collegare il connettore rapido dal chip microfluidico alla porta corrispondente sul sistema omico, seguendo i collegamenti appropriati.

Una volta completata l'installazione del chip, viene visualizzata una finestra pop-up con il messaggio "la valvola di bloccaggio del tubo a gocciolina è aperta". Fare clic su OK quando l'installazione del chip per la generazione di microtubi e goccioline è completata. Dopo essersi assicurati che tutti i tubi siano collegati correttamente alle valvole a morsetto corrispondenti, fare clic su OK.

Prima di eseguire l'inizializzazione, fare clic sull'interfaccia di impostazione per configurare i parametri pertinenti, come la modalità selettiva, la temperatura di incubazione, il tempo di incubazione, la velocità dell'agitatore, la lunghezza d'onda di rilevamento OD e la lunghezza d'onda di eccitazione ed emissione per il rilevamento della fluorescenza. Passare all'interfaccia principale e fare clic su Inizializza. Viene visualizzata la finestra pop-up di conferma fare clic su Sì per consentire al sistema IC di eseguire un autocontrollo dei suoi componenti, tra cui la pompa di iniezione, le impostazioni di temperatura, il test di scarico del liquido di scarto, il modulo di screening e il modulo di rilevamento delle goccioline.

Al termine dell'inizializzazione, fare clic su OK nella finestra popup. Per preparare il campione, prelevare il campione microbico ed eseguire la diluizione seriale con il mezzo corrispondente per ottenere una concentrazione di circa 50 cellule per millilitro per ottenere una sospensione di campione da 40 millilitri. Quindi svitare il tappo del flacone del campione e versare la sospensione fecale diluita nel flacone con un'ancoretta magnetica, fino alla posizione di aggiunta del campione.

Avvitare il tappo e serrarlo saldamente. Quindi inserire il connettore rapido A nel connettore rapido B per completare il processo di caricamento del campione. Dopo aver posizionato il flacone del campione nella posizione designata, separare i connettori rapidi A e B dal flacone del campione.

Collegare il connettore rapido A del flacone del campione alla porta O3 del sistema omico. Collegare il connettore C3 sul chip microfluidico al connettore rapido B e chiudere lo sportello della camera. Nell'interfaccia principale del software, selezionare il numero desiderato di tubi per goccioline da generare e fare clic su Produci per avviare la generazione di goccioline a cella singola.

Attendi la finestra popup che indica il completamento della creazione del droplet e fai clic su OK. Chiudere il morsetto sui tre connettori e rimuovere il flacone del campione. Nell'interfaccia principale del software, selezionare lo stesso numero di tubo per gocce utilizzato durante la generazione delle gocce.

Fare clic su Cultura. Confermare il tempo e la temperatura di coltivazione e iniziare il processo. Attendi la finestra pop-up, che indica il completamento della coltivazione delle gocce.

Premere il pulsante UV sul sistema ottico per attivare la luce UV ultravioletta. Irradiare la camera di rilevamento e raccolta delle goccioline per 30 minuti prima di spegnerla. In un banco super pulito, aprire tutte le piastre da 96 pozzetti utilizzate per la raccolta delle goccioline e impilarle una sopra l'altra senza coperchi, numerandole in sequenza dal basso verso l'alto.

Assicurarsi che la piastra del pozzetto superiore sia coperta con un coperchio. Aprire lo sportello della camera di rilevamento e raccolta delle goccioline e posizionare le piastre dei pozzetti nelle posizioni designate. Rimuovere il coperchio dalla piastra del pozzetto superiore, quindi chiudere lo sportello della camera.

Riaccendere la luce UV sul sistema omico per 30 minuti per eseguire la sterilizzazione secondaria. Quindi, rimuovere il dispositivo di rimozione delle bolle d'aria dalla sua posizione di posizionamento. Svitare il tappo e rimuovere la vite a forma di farfalla dal tappo.

Versare 200 millilitri di olio per la rimozione delle bolle d'aria nel dispositivo di rimozione delle bolle d'aria. Fissare saldamente il tappo, quindi fissare il dispositivo di rimozione delle bolle d'aria capovolto nella posizione designata. Nell'interfaccia principale, selezionare il tubo delle gocce per l'ordinamento.

Fare clic su ordinamento. Inserire il numero di piastre a pozzetti da raccogliere e avviare il processo di smistamento. Osservare l'area di visualizzazione del processo per misurare in tempo reale la densità ottica delle goccioline o i valori di fluorescenza.

Analizzare circa 20-30 goccioline per controllare il valore OD. Se la maggior parte delle goccioline ha un diametro esterno di circa 0,2, impostare la soglia inferiore di diametro esterno su 0,5 e la soglia di diametro esterno superiore su quattro. Il sistema raccoglierà automaticamente le goccioline all'interno di questo intervallo nelle piastre a 96 pozzetti.

Attendi la finestra pop-up che indica il completamento dell'ordinamento e della raccolta dei droplet, quindi fai clic su OK. Aprire lo sportello della camera di rilevamento e raccolta delle goccioline. Posizionare il coperchio della piastra a pozzetti sulla piastra a pozzetti superiore e rimuovere le piastre insieme.

Fare clic su Esporta dati per salvare i dati del segnale delle goccioline raccolti. Fare clic su mappa termica. Selezionare il file di dati di raccolta delle goccioline e osservare il diametro esterno visualizzato nel formato della micropiastra.

Visualizza questi valori OD come una mappa termica in cui l'intensità del colore corrisponde alla distribuzione OD tra i pozzetti, fornendo una rappresentazione chiara e intuitiva. La diversità delle specie del microbiota intestinale umano ottenuta dal sistema omico, il metodo della piastra solida e il campione iniziale di feci sono stati confrontati a livello familiare. 34 famiglie microbiche sono state arricchite sia con il metodo su piastra solida che con il metodo omico dimostrato, con il sistema omico che ha ulteriormente arricchito quattro famiglie.

Il sistema omico ha anche arricchito efficacemente alcune delle famiglie a bassa abbondanza. A livello di genere, entrambi i metodi hanno arricchito 74 generi microbici, mentre il metodo delle cellule MISS ha arricchito ulteriormente 13 generi. Inoltre, due generi inizialmente presenti a bassa abbondanza sono stati efficacemente arricchiti, utilizzando il sistema OMIC.

Questi risultati hanno mostrato che il metodo di coltura cellulare MISS ha fornito migliori condizioni di crescita per quei ceppi che erano presenti in basse proporzioni o avevano scarse prestazioni di crescita nella sospensione microbica originale.