Rilevamento basato sulla fluorescenza dell'attività della nucleasi FEN1 e screening di inibitori di piccole molecole

Abbiamo sviluppato un metodo basato sulla fluorescenza per rilevare le attività della nucleasi FEN1 e lo screening degli inibitori di piccole molecole, facendo progredire la diagnostica e la ricerca terapeutica mirata.

Le attuali sfide di espressione includono la complessità e i problemi di sicurezza dei metodi convenzionali, insieme ai costi elevati e alle apparecchiature specializzate necessarie per le tecniche esistenti basate sulla fluorescenza.

Questo protocollo ha affrontato le carenze del metodo radiologico tradizionale e le tecniche di fluorescenza ad alto costo, fornendo una soluzione di rilevamento più sicura, efficiente e facile da usare.

Il nostro laboratorio si concentrerà sull'ottimizzazione di una piattaforma di screening ad alto rendimento per esplorare le applicazioni in vivo e i meccanismi degli inibitori di FEN1 nella terapia del cancro.

[Istruttore] Per iniziare, progettare filamenti di oligonucleotidi di DNA basati sull'attività di scissione specifica di FEN1. Mescolare gli oligonucleotidi di DNA a filamento singolo in un tampone di ricottura. Aggiungere 10 microlitri di tampone di ricottura e acqua deionizzata per ottenere un volume totale di 50 microlitri. Quindi, scaldare la miscela di reazione a 100 gradi Celsius per un minuto in un bagno di metallo. Trasferire immediatamente la provetta a 72 gradi Celsius e incubare per 10 minuti. Quindi, spegnere la fonte di calore e lasciare che la soluzione si raffreddi gradualmente a temperatura ambiente per formare il substrato completo di DNA a doppio filamento. Per il saggio dell'attività nucleasica della FEN1, combinare prima due microlitri del substrato del DNA con la nucleasi FEN1 nel tampone di reazione. Incubare la miscela di reazione in un bagno di metallo a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Aggiungere 20 microlitri di tampone di terminazione 2X per fermare la reazione. Quindi, caricare 20 microlitri del campione terminato su un gel di poliacrilammide denaturante al 12% pre-preparato. Elettroforare il gel a 100 volt per 60 minuti. Una volta completato, visualizza i risultati dell'elettroforesi con un sistema di imaging a fluorescenza. Con una pipetta, trasferire due microlitri di dimetilsolfossido in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Aggiungere due microlitri di nucleasi FEN1 e 10 microlitri di tampone di reazione 2X alla provetta e sei microlitri di acqua deionizzata. Mescolare accuratamente la soluzione, quindi incubarla con ghiaccio per 10 minuti. Dopo l'incubazione, pipettare due microlitri di substrato di DNA per raggiungere un volume di reazione finale di 20 microlitri. Successivamente, preparare una diluizione di lavoro dell'inibitore della nucleasi FEN1 FEN1-IN-4 eseguendo una doppia diluizione seriale da una soluzione madre di un molare in dimetilsolfossido. Pipettare due microlitri ciascuno di nucleasi FEN1 e l'inibitore FEN1-IN-4 diluito in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri. Quindi, pipettare 10 microlitri di tampone di reazione 2X e quattro microlitri di acqua deionizzata. Mescolare delicatamente e incubare il composto con ghiaccio per 10 minuti. Ora, aggiungi due microlitri di substrato di DNA al tubo per ottenere il volume finale a 20 microlitri. Incubare la miscela di reazione a 37 gradi Celsius in un bagno di metallo per 15 minuti. Quindi, terminare la reazione aggiungendo 20 microlitri di tampone di terminazione. Una chiara banda proteica a circa 45 kilodalton ha confermato il successo della purificazione della nucleasi FEN1 dall'espressione indotta. Il substrato di DNA a doppio filamento marcato con fluoresceina è apparso a 80 kilodalton, confermando il successo della sintesi rispetto al substrato a singolo filamento a 59 kilodalton. La nucleasi FEN1 ha scisso il substrato di DNA a doppio filamento da 80 nucleotidi in modo dose-dipendente, con una scissione completa osservata a 0,5 microgrammi per microlitro. Il composto FEN1-IN-4 ha inibito significativamente la scissione del substrato di DNA a doppio filamento da parte di FEN1, come dimostrato dalla ritenzione della banda di 80 nucleotidi. FEN1-IN-4 ha ridotto l'attività nucleasica di FEN1 in modo concentrazione-dipendente, con una concentrazione inibitoria semimassima di 14,03 micromolare.