Screening CRISPR a livello di genoma per svelare geni radiosensibili e radioresistenti

Questa ricerca si concentra sullo screening CRISPR a livello di genoma e sulla radioterapia. Forniamo un protocollo per visualizzare geni radiosensibili e radioresistenti utilizzando uno screening CRISPR a livello di genoma in cellule di cancro del polmone dopo irradiazione. Le attuali sfide sperimentali includono gli effetti off-target, causati dalla grande complessità del genoma e dalle potenziali difficoltà nell'esplorare i meccanismi sottostanti. Rispetto ai metodi di screening tradizionali, CRISPR raggiunge una modificazione genetica permanente e mostra una precisione superiore, il che lo rende particolarmente prezioso nella ricerca genomica funzionale e nella scoperta di bersagli. In futuro, il nostro team si concentrerà sullo studio dello schermo CRISPR in vivo per risolvere i problemi lasciati da questa ricerca e ci impegneremo a ottimizzare la tecnologia CRISPR.

[Narratore] Per iniziare, regolare la densità delle celle aderenti a cinque volte 10 alla potenza di cinque cellule per millilitro. Utilizzando una pipetta, distribuire due millilitri di sospensione cellulare in ciascuna piastra di coltura da 3,5 centimetri per il trattamento con radiazioni a dosi diverse. Metti le piastre in un'incubatrice impostata a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica e incuba per una notte. Numerare ogni piatto di coltura da 3,5 centimetri da uno a cinque, usando un pennarello. Utilizzando una sorgente di radiazioni, somministrare dosi di radiazioni di 2, 4, 6 e 8 grigi, rispettivamente, alle stoviglie da due a cinque. Regolare la densità delle celle irradiate a una volta per 10 alla potenza di cinque celle per millilitro. Seminare 10 microlitri per pozzetto, corrispondenti a 1000 cellule per 100 microlitri, in piastre a sei pozzetti con tre repliche per dose di radiazioni. Quindi seminare 30 microlitri per pozzetto, corrispondenti a 3000 cellule per 100 microlitri, in piastre da 96 pozzetti con cinque repliche per dose di radiazioni. A questo punto, miscelare il reagente CCK-8 con il terreno RPMI 1640 senza FBS in un rapporto da uno a nove. Aggiungere la miscela alla piastra a 96 pozzetti e incubare la piastra al buio per un'ora. Quindi utilizzare un lettore di micropiastre per misurare la densità ottica a 450 nanometri. Per iniziare il processo di infezione, impostare un gradiente di concentrazione logaritmico per lentivirus da zero a 800 unità per millilitro. Aggiungere il volume corrispondente di lentivirus a due microlitri di polybrene per piatto e lasciare equilibrare a temperatura ambiente per cinque minuti. Versare lentamente la miscela di lentivirus polybrene in ogni pozzetto. Regolare la densità delle cellule parentali a tre volte 10 alla potenza di cinque cellule per millilitro e inoculare un millilitro in ciascun pozzetto di una piastra a 12 pozzetti. Aggiungere la puromicina in un gradiente di concentrazione ai pozzetti. Dopo 72 ore dall'infezione, sostituire il terreno in ciascun pozzetto con un terreno completo contenente la concentrazione minima di puromicina per l'uccisione cellulare. Calcola la molteplicità dell'infezione per ogni pozzetto in base alle cellule sopravvissute. Regolare la densità delle celle aderenti a una volta per 10 alla potenza di sette celle per millilitro. Aggiungere il lentivirus a una molteplicità di infezione pari a 0,3 in 30 microlitri per piatto di polibrene e lasciarlo equilibrare a temperatura ambiente per cinque minuti. Versare lentamente la miscela di lentivirus e polibrene nel piatto di coltura da 15 centimetri. Mescolare bene e incubare per una notte a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Il secondo giorno dopo l'infezione, aspirare il terreno dalla piastra di coltura e sostituirlo con 15 millilitri di terreno completo RPMI 1640 contenente il 10% di FBS. Ripetere lo stesso trattamento per le cellule parentali non infette come controllo negativo e continuare la coltura per 72 ore. Ora, digerire le cellule da un piatto di coltura da 15 centimetri usando lo 0,25% di tripsina. Risospendere le celle nel terreno completo RPMI 1640 con il 10% di PBS e contare il numero di celle. Dopo aver estratto il DNA genomico per il giorno zero, utilizzare uno spettrofotometro UV NanoDrop per misurare la concentrazione e la purezza del DNA. Somministrare una dose appropriata di radiazioni alle cellule del gruppo di trattamento e lasciare che le cellule del gruppo di controllo non trattate si propaghino normalmente. Dopo 14 giorni di trattamento, digerire sia le cellule del gruppo di trattamento che quelle del gruppo di controllo utilizzando tripsina allo 0,25%. Risospendere le celle in terreno completo RPMI 1640 con il 10% di FBS. Centrifugare le cellule a 300 g per cinque minuti ed eliminare il surnatante. Risospendere il pellet in un millilitro di PBS. Dopo aver ripetuto la fase di centrifugazione, estrarre il DNA genomico del giorno 14 dal pellet e determinare la concentrazione di DNA. Successivamente, preparare i primer necessari e diluirli a 10 micromolari. Dopo aver aggiunto i componenti per impostare un sistema di reazione da 20 microlitri, centrifugare brevemente la provetta a 300 G per cinque secondi. Per l'elettroforesi su gel di agarosio, preparare il gel, rimuovere il pettine da esso e riempire il serbatoio dell'elettroforesi con un tampone sufficiente a coprire il gel. Aggiungere il tampone di caricamento al campione di DNA e mescolare bene. Infine, caricare la miscela nei pozzetti e iniziare l'elettroforesi Formazione di colonie dopo 14 giorni ha rivelato che l'esposizione a due Gray di radiazioni ha ridotto significativamente il numero di colonie sopravvissute rispetto a zero Gray. Il test CCKA ha mostrato un sostanziale declino della vitalità cellulare a due Gray con un ulteriore decremento a dosi di radiazioni più elevate. Il trattamento con concentrazioni crescenti di puromicina per 72 ore ha dimostrato che un micromolare era la concentrazione minima richiesta per eliminare le cellule A549. La validazione della PCR ha mostrato bande distinte in 231 coppie di basi, confermando la lunghezza prevista delle sequenze di sgRNA nella libreria CRISPR. L'analisi del sequenziamento ha rivelato che circa il 60% delle letture è stato mappato con successo sul genoma di riferimento. I conteggi delle letture di sgRNA hanno seguito una distribuzione di Poisson, che corrisponde alle aspettative teoriche per uno screening su scala genomica. L'analisi della PCA e della mappa di calore ha mostrato un'elevata variabilità intergruppo e una bassa variabilità intergruppo, convalidando la coerenza sperimentale. L'analisi dell'ontologia genica ha identificato la risposta al danno al DNA come una delle principali vie arricchite tra i primi 15 risultati.