Un Chirurgia Procedura Craniotomia per l'imaging cerebrale cronica

Le tecniche di imaging stanno diventando sempre più importanti nello studio della funzione cerebrale. Tra questi, la microscopia laser a due fotoni si è affermata come una metodica estremamente utile perché permette lo studio del cervello dell'anta dal vivo e con preparazioni appropriate. Questa tecnica consente l'osservazione cronica della stessa area corticale da minuti a mesi.

In questo video, mostriamo una preparazione per l'imaging cronico in vivo del cervello utilizzando due fotomicroscopie. Il Dr.Carl Voda, un ricercatore dell'Howard Hughes Medical Institute presso Janelia Farm, ha inizialmente aperto la strada alla preparazione della finestra cranica che dimostreremo oggi. Ciao E Ricardo deve dal laboratorio di Carlos Porter Cayo nel Dipartimento di Neurologia dell'Università della California di Los Angeles.

Oggi vi mostreremo la procedura per creare una finestra cranica per l'imaging cronico in vivo. Questa preparazione è molto utile perché consente di visualizzare in profondità all'interno del cervello utilizzando il microscopio laser a fotoni. Quindi iniziamo.

Prima di iniziare l'intervento chirurgico, i topi vengono anestetizzati con fluoro. 4% per l'induzione, da un punto mezzo al 2% per la chirurgia, utilizzando procedure approvate I-A-C-U-C, è importante utilizzare pizzichi per la coda e/o le dita dei piedi per garantire che l'animale sia completamente sedato. Utilizzando un rifinitore per roditori, i peli dalla parte posteriore del collo fino agli occhi vengono rasati.

Dopo la rasatura, il mouse viene posizionato su un telaio stereotassico, appoggiato su una coperta a ricircolo d'acqua impostata A 37 gradi Celsius, la testa è saldamente fissata mediante barre auricolari. Viene quindi applicato un unguento per gli occhi per evitare che l'occhio dell'animale si secchi. Successivamente, vengono somministrati per via sottocutanea desametasone, 0,2 milligrammi per chilogrammo e carprofene cinque milligrammi per chilogrammo.

Al fine di prevenire il gonfiore del cervello e/o una risposta infiammatoria rispettivamente. Prima di iniziare l'intervento, assicurarsi di sterilizzare l'area operatoria strofinando la pelle con tre tamponi alternati di alcol al 70% e Betadine. Tutti gli strumenti chirurgici sono stati pre-sterilizzati utilizzando uno sterilizzatore a microsfere di vetro utilizzando forbici spruzzate con etanolo.

La pelle sopra la parte superiore del cranio viene rimossa, iniziando con un taglio orizzontale lungo la base della testa, seguito da due tagli in direzione rostrale, che raggiungono quasi le palpebre. Poi due tagli obliqui che convergono sulla linea mediana. A questo punto, una goccia di soluzione di lidocaina ed epinefrina viene applicata sul periostio per evitare sanguinamento eccessivo o dolore con un bisturi, il periostio viene retratto fino ai bordi del cranio.

Anche la muscolatura della parte posteriore del collo è leggermente retratta. L'intera area esposta del cranio viene quindi raschiata delicatamente con un bisturi per creare una superficie asciutta. Questo è molto importante perché permetterà alla colla di aderire meglio quando verrà applicata successivamente.

Una volta scelto un sito di imaging, si è pronti per creare prima la finestra cranica. Un cerchio di circa quattro millimetri di diametro viene disegnato delicatamente con un trapano dentale pneumatico. Dopo una leggera perforazione, la soluzione di lidocaina epinefrina viene applicata nuovamente sulla superficie del cranio.

La perforazione viene interrotta quando rimane uno strato molto sottile di osso, di solito un naso. Questo stadio viene raggiunto spingendo delicatamente sul centro della loro craniotomia per sentire come cede sotto una goccia di soluzione salina e sfruttando la trabecola ossea. Una struttura spugnosa dell'osso.

La craniotomia viene sollevata dal cranio con una pinza a punta molto sottile. La soluzione salina è importante perché aiuta a sollevare il cranio e a prevenire il sanguinamento della dura dura. Successivamente, la schiuma di gel che è stata precedentemente imbevuta di soluzione salina viene applicata alla dura per fermare qualsiasi piccolo sanguinamento che a volte si verifica quando il cranio viene rimosso.

Dopo aver asciugato la superficie della dura matter e aver assicurato che non vi siano sanguinamenti, un vetrino di vetro sterile da cinque millimetri viene delicatamente posato sopra la dura matter. Una goccia di colla a base di cianoacrilato viene applicata all'emisfero opposto del cranio. Con l'aiuto di un ago, la colla viene applicata delicatamente tutto intorno alla finestra con attenzione a non metterla sotto il vetro.

La colla può ora essere applicata in uno strato sottile su tutta la superficie del cranio. Una volta che la colla si è asciugata, l'acrilico dentale viene miscelato e applicato su tutta la superficie del cranio, coprendo anche un piccolo bordo del vetrino coprioggetti per fissarlo. Dopo aver fissato il vetrino coprioggetto, viene realizzato un piccolo pozzetto attorno alla finestra con acrilico dentale.

Una barra di titanio è anche incorporata nell'acrilico dentale. Questa barra verrà successivamente utilizzata per fissare saldamente il mouse al tavolino del microscopio. Per l'imaging, è importante assicurarsi che la barra sia a livello in modo che sia parallela a una finestra cranica.

Posizionare un pezzo di carta sotto la barra può consentire alla barra di rimanere in piano mentre l'acrilico si indurisce, l'acrilico dentale viene lasciato indurire o indurire per 10 minuti, momento in cui la barra di titanio è stata fissata in posizione. L'animale viene quindi posto in una gabbia calda fino a quando non si riprende. Dopo il recupero dall'anestesia, l'animale può essere visualizzato lo stesso giorno.

Questo filmato mostra una pila di 160 immagini scattate a intervalli di cinque micron con il nostro microscopio a due fotoni costruito su misura attraverso una finestra cranica posizionata sopra la corteccia somatosensoriale di un topo GFPM di tre mesi. Questa linea transgenica di topi esprime GFP in un piccolo sottogruppo di neuroni parmali. Nel livello cinque e nel livello due tre, l'immagine è stata scattata con un obiettivo a immersione in acqua 40 x con apertura numerica di 0,8 utilizzando una lunghezza d'onda di eccitazione di 910 nanometri.

Nelle immagini più superficiali è facile riconoscere gli arbori dendritici dei dendriti apicali delle cellule parametalliche. Il ciuffo apicale dei dendriti di ciascun neurone converge su un unico grande dendrite apicale. Si possono anche vedere dendriti obliqui più piccoli che escono da questo principale sono evidenti anche gli assoni apicali principali che attraversano il campo visivo.

Si tratta di una pila di 12 immagini che scattano ogni micron e mezzo utilizzando lo stesso obiettivo 40x a un ingrandimento maggiore, un dendrite superficiale viene mostrato ad alta risoluzione sufficiente a risolvere le singole spine dendritiche. Ti abbiamo appena mostrato come eseguire una preparazione della finestra cranica per l'imaging cronico del cervello utilizzando la microscopia fotografica. Questo è un metodo estremamente potente per lo studio del cervello perché consente di studiare sia la struttura che la funzione del cervello vivente, non solo in una singola immaginazione, ma anche cronicamente attraverso più immaginazioni per periodi di mesi.

Un altro vantaggio della preparazione della finestra cranica è che è possibile visualizzare un ampio riempimento della vista, il che rende possibile l'imaging di strutture di grandi dimensioni come un'intera azione o l'albero interno su un arco di millimetri. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordarsi di lavorare nelle condizioni più pulite e sterili possibili e di avere una mano molto ferma. Va bene, e questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.