Name: Visualizzazione a fluorescenza a singola molecola della dinamica della DNA polimerasi ai G-quadruplex (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-04T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 37 s
Description: Scopri la dinamica della DNA polimerasi delta ai G-quadruplex mediante microscopia a fluorescenza a singola molecola. Questo metodo rivela un nuovo percorso di scambio durante la replicazione del DNA.

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<ol><li>Sutton, M. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Managing+DNA+polymerases%3A+Coordinating+DNA+replication%2C+DNA+repair%2C+and+DNA+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Managing DNA polymerases: Coordinating DNA replication, DNA repair, and DNA recombination.</a> Proc Natl Acad Sci. 98 (15), 8342-8349 (2001).</li>
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<li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunability+of+DNA+polymerase+stability+during+eukaryotic+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Tunability of DNA polymerase stability during eukaryotic DNA replication.</a> Mol Cell. 77 (1), 17-25 (2020).</li>
<li>Chilkova, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+eukaryotic+leading+and+lagging+strand+DNA+polymerases+are+loaded+onto+primer-ends+via+separate+mechanisms+but+have+comparable+processivity+in+the+presence+of+PCNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The eukaryotic leading and lagging strand DNA polymerases are loaded onto primer-ends via separate mechanisms but have comparable processivity in the presence of PCNA.</a> Nucleic Acids Res. 35 (19), 6588-6597 (2007).</li>
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<li>Mueller, S. H., Spenkelink, L. M., Van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+proteins+play+tag%3A+The+dynamic+nature+of+the+replisome%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Rev%22%5BJournal%5D)">When proteins play tag: The dynamic nature of the replisome.</a> Biophys Rev. 11 (4), 641-651 (2019).</li>
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<li>Clayton Kaguni, L. S., A, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Template-directed+pausing+in+in+vitro+DNA+synthesis+by+DNA+polymerase+a+from+Drosophila+melanogaster+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Template-directed pausing in in vitro DNA synthesis by DNA polymerase a from Drosophila melanogaster embryos.</a> Proc Natl Acad Sci. 79 (4), 983-987 (1982).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>Modello di DNA di controllo 100 nt</td><td>Tecnologie del DNA integrate Stampo</td><td></td><td>di controllo primario nei saggi di estensione del primer</td></tr><tr><td>Modello di DNA di formazione G4 da 100 nt</td><td>Tecnologie</td><td></td> del DNA integrato <td>Modello primario di formazione G4 nei saggi di estensione del primer</td></tr><tr><td>15% Mini-PROTEAN TBE-Urea Gel, 12 pozzetti, 20 &; L</td><td>Bio-Rad</td><td>4566055</td><td>Elettroforesi su gel</td></tr><tr><td>20 nt Oligonucleotide primer marcato/biotinilato</td><td>Tecnologie DNA integrate Necessario</td><td></td><td>per l'estensione del primer dei modelli da 100 nt Modello di</td></tr><tr><td>DNA di controllo da 22 nt</td><td>Tecnologie</td><td></td> del DNA integrate <td>Modello di controllo primario in esperimenti di spettroscopia di dicroismo circolare</td></tr><tr><td>Modello di DNA da 22 nt che forma G4</td><td> Tecnologie</td><td></td><td>Modello primario di formazione G4 in esperimenti di spettroscopia di dicroismo circolare</td></tr><tr><td>24 x 24 mm vetrino coprioggetti</td><td>Marienfeld 100062 superiore</td><td></td><td>Richiesto per la microscopia TIRF</td></tr><tr><td>3-amminopropiltrietossisilano</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10668.22</td><td>Funzionalizzazione del vetrino coprioggetti</td></tr><tr><td>Laser a 647 nm</td><td></td><td>1196627</td><td>coerente Selezionare la lunghezza d'onda per corrispondere alla colorazione/colorante di filtro</td></tr> di <tr><td>emissione a 670 nm</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>ET655lp</td><td>Assicura che solo le lunghezze d'onda rilevanti vengano lasciate passare al rivelatore</td></tr><tr><td>Amersham Typhoon 5 imager biomolecolare</td><td>Cytiva</td><td>29187191</td><td>Analisi del gel</td></tr><tr><td>Biotin-PEG-SVA (MW 5000)</td><td>Laysan Bio</td><td>BIO-PEG-SVA-5K-100MG</td><td>Funzionalizzazione del vetrino coprioggetti</td></tr><tr><td>Miscela di soluzioni di desossinucleotidi trifosfato</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-1005L</td><td>Elementi costitutivi della replicazione</td></tr><tr><td>Bagno secco digitale (115V)</td><td>Bio-Rad</td><td>1660571</td><td>Soluzioni di riscaldamento</td></tr><tr><td>Ditiotreitolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>646563</td><td>Riduzione del legame disolfuro</td></tr><tr><td>Telecamera EM-CCD</td><td>Andor</td><td>iXon 897</td><td>Cattura di filmati a singola molecola</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9037</td><td>Denaturazione del DNA durante saggi di replicazione del DNA d'insieme</td></tr><tr><td>Siringa a tenuta di gas, 1 mL</td><td>SGE</td><td>21964</td><td>Cuvetta di riempimento per spettroscopia di dicroismo circolare</td></tr><tr><td>Microscopio invertito con obiettivo a immersione in olio CFI Apo TIRF 100x</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>Eclipse Ti-E</td><td>Facilita la microscopia TIRF a singola molecola</td></tr><tr><td>Spettrofotometro J-810</td><td>Jasco</td><td>J-810</td><td>Misurazione della spettroscopia di dicroismo circolare</td></tr><tr><td>mPEG-SVA (MW 5000)</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SVA-5K-100MG</td><td>Funzionalizzazione del vetrino coprioggetto</td></tr><tr><td>Spettrofotometro</td><td>NanoDrop One Thermofisher Scientific</td><td>ND-ONE</td><td>Misurazione delle concentrazioni di</td></tr> <tr><td>proteine ed etichetteNeutrAvidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31000</td><td>Tethering dei modelli di DNA ai vetrini protettivi funzionalizzati durante gli esperimenti a singola molecola</td></tr><tr><td>Tubo in polietilene</td><td>Instech</td><td>BTPE-60</td><td>Necessario per la costruzione delle celle a flusso</td></tr><tr><td>Cuvetta al quarzo, 10 mm</td><td>Starna Scientific</td><td>1/Q/10/CD</td><td>Contiene il campione per la spettroscopia di dicroismo circolare</td></tr><tr><td>Pompa a siringa</td><td>Adelab Scientific</td><td>NE-1002X</td><td>Utilizzato per far fluire tamponi e substrati attraverso una cella a flusso microfluidico Tampone</td></tr><tr><td>Tris-EDTA</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>93283</td><td>Soluzione tampone DNA</td></tr><tr><td>Polimerasi e delta di lievito;</td><td>Michael O'Donnell Lab</td><td></td><td>Replicazione dei modelli di DNA</td></tr><tr><td>Colonna di desalinizzazione Zeba spin, 7 K MWCO, 0,5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89882</td><td>Purificazione della polimerasi</td></tr></tbody></table>

visualizzazione a fluorescenza a singola molecola della dinamica della dna polimerasi ai g-quadruplex

Single-Molecule Fluorescence Visualization of DNA Polymerase Dynamics at G-Quadruplexes

Per questo saggio, sono stati progettati due substrati di DNA con un primer da 20 nt marcato in fluorescenza: uno contenente una sequenza di formazione G4 (Figura 1A, a sinistra) e uno privo di questa sequenza (Figura 1A, a destra). Per confermare che il G-quadruplex è un efficace ostacolo all'attività della polimerasi, la sintesi del DNA da parte di Pol δ è stata monitorata su un gel denaturante PAGE. L'attività del δ di Pol marcato purificato sui substrati di DNA è stata esaminata mediante elettroforesi su gel. La Figura 1B (a sinistra) mostra che il Pol marcato in fluorescenza δ non è in grado di sintetizzare oltre il G-quadruplex. Prima dell'inizio della sintesi (t = 0 min), è presente una banda corrispondente a 20 nt, che rappresenta il primer marcato che è stato denaturato dal filamento stampo. Dopo 3 minuti, questa banda di 20 nt è stata convertita in una banda di 60 nt, indicando che la sintesi è avvenuta su tutto il DNA e confermando che la polimerasi era completamente bloccata dalla struttura G-quadruplex. Questo blocco implica che la polimerasi non potrebbe né dispiegarsi né bypassare la struttura. Al contrario, la sintesi di un modello di controllo che non contiene la sequenza di formazione G-quadruplex (Figura 1A, a destra) ha prodotto una banda di 100 nt dopo 3 minuti (Figura 1B, a destra).
Dopo aver confermato la sintesi sui modelli e il blocco efficiente da parte del G-quadruplex, queste misurazioni sono state ripetute su un microscopio a fluorescenza a singola molecola per monitorare il comportamento della polimerasi. I modelli di DNA sono stati legati a vetrini coprioggetti funzionalizzati (Figura 2A) in una cella a flusso microfluidico e la posizione di ciascun substrato è stata determinata visualizzando il primer marcato in fluorescenza. Quindi, il Pol δ marcato è stato caricato in presenza di dNTP per avviare la sintesi. All'interno di un FOV tipico, i singoli punti vengono tracciati per quantificare la frequenza con cui Pol δ si lega e si dissocia dal DNA (Figura 2B, C). Misurando l'intensità in funzione del tempo su ciascun substrato di DNA, è possibile generare traiettorie di singole molecole (Figura 2C, Figura 3 supplementare). È possibile misurare il caratteristico "tempo di permanenza", ovvero la durata media in cui Pol δ rimane legato al modello. Per il substrato G4, il tempo di permanenza è stato determinato in 6 s ± 2 s, mentre per il substrato di controllo è stato di 10 s ± 3 s (Figura 2D, Figura 4 supplementare). Inoltre, per ogni traiettoria, è possibile quantificare il numero di volte in cui Pol δ si lega al modello. Il numero di eventi di legame al substrato G4 è molto più elevato rispetto al modello di controllo (Figura 2E). Mentre ci sono casi di più di un evento di legame nel modello di controllo a causa del legame e dello svincolo scolastico, c'è un chiaro aumento del numero di eventi di legame in media per il modello di formazione G4. Ciò suggerisce che, dopo che la sintesi è stata interrotta dal G-quadruplex, la polimerasi legata si dissocia dal DNA prima che le nuove polimerasi dalla soluzione inizino un ciclo continuo di legame e dislegamento. Pertanto, questo saggio a singola molecola fornisce una visione senza precedenti di come le DNA polimerasi rispondono agli ostacoli del DNA.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68080/68080fig01.jpg"> 
Figura 1: Saggio di estensione del primer d'insieme. (A) Rappresentazione schematica dei substrati del DNA. Il substrato G4 (a sinistra) contiene una sequenza G-quadruplex-forming, mentre il substrato di controllo (a destra) no. (B) Saggio di estensione della primasi del DNA d'insieme del G4 innescato e dei substrati del DNA di controllo che mostrano che il lievito Pol δ marcato in fluorescenza è completamente bloccato dal G-quadruplex. Il gel PAGE mostra la replicazione dei modelli di DNA nel tempo, determinando uno spostamento del primer da 20 nt marcato nel prodotto da 60 nt per il substrato G4 (a sinistra) e dal prodotto da 100 nt per il modello di controllo (a destra). M rappresenta una scala contenente oligo marcati 20 nt, 60 nt e 100 nt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/68080fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68080/68080fig02.jpg"> 
Figura 2: Microscopia a fluorescenza a singola molecola. (A) Rappresentazione schematica del saggio di estensione del primer a singola molecola utilizzando il Pol δ di lievito marcato con AF647. (B) FOV tipico ottenuto da un saggio a singola molecola. Ogni punto rappresenta un δ Pol marcato in fluorescenza che si lega a un modello di DNA. Barra della scala: 10 μm. (C) (In alto) Esempio di molecola del saggio a singola molecola che mostra il legame on/off durante gli scambi di Pol δ. (In basso) Traiettoria di una singola molecola della stessa molecola che mostra l'intensità nel corso del tempo dell'esperimento. La linea nera rappresenta l'adattamento del modello di Markov nascosto (HMM) ai dati. (D) Tempo di permanenza di Pol δ sul substrato G4 (viola) e sul substrato di controllo (grigio). Le linee rappresentano adattamenti esponenziali, con una durata di 6 s ± 2 s sul substrato G4 e di 10 s ± 3 s sul substrato di controllo. (E) Numero di eventi di legame di Pol δ a singoli substrati di DNA. Il numero mediano di eventi di legame sul substrato G4 (viola) è 3,5, rispetto al substrato di controllo 1 (grigio). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/68080fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Figura supplementare 1: Spettroscopia CD. Spettri CD della sequenza di formazione G4 (viola) e di controllo (grigio) in tampone TE contenente 200 mM di KCl a 25 °C. Il picco caratteristico a 260 nm, seguito dal picco negativo a 240 nm, è caratteristico di un GQ intramolecolare parallelo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/Supp%20Figure%201%20(CD).pdf" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Figura 2 supplementare: Costruzione di celle a flusso. (A) Schema dei singoli pezzi della cella a flusso. Il blocco PDMS quadrato si trova sopra il vetrino coprioggetti del microscopio. Questi pezzi vengono quindi inseriti insieme all'interno del coperchio e del fondo del supporto della cella di flusso. (B) La cella a flusso completa. I tubi possono essere inseriti in ciascun lato del blocco PDMS per formare i canali attraverso i quali i tamponi possono essere fatti fluire attraverso il dispositivo tramite microfluidica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/Supp%20Figure%202%20(Flow%20Cell).pdf" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Figura 3 supplementare: Traiettorie di singole molecole. (A) Esempio di traiettoria di una molecola sottoposta a un singolo evento di legame durante l'intervallo di tempo di 10 minuti dell'esperimento. (B) Esempio di traiettoria di una molecola che subisce zero eventi di legame durante l'intervallo di tempo di 10 minuti dell'esperimento. La linea nera in (A) e (B) rappresenta l'adattamento del modello di Markov nascosto (HMM) ai dati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/Supp%20Figure%203%20(Extra%20Traces).pdf" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Figura supplementare 4: Tempi di sosta. (A) Tempo di permanenza di Pol δ sul substrato G4. La linea rappresenta l'adattamento esponenziale, fornendo una durata di 6 s ± 2 s. (B) Tempo di permanenza di Pol δ sul substrato di controllo. L'adattamento esponenziale garantisce una durata di 10 s ± 3 s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/Supp%20Figure%204%20(Split%20Lifetimes).pdf" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Figura supplementare 5: Controllo del fotosbiancamento. Il grafico mostra il tempo medio per la fotosbiancamento di un singolo enzima Pol δ di lievito marcato con AF647 dal laser a 647 nm. La linea rappresenta l'adattamento esponenziale, dando una durata di 39 ± 6 s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/Supp%20Figure%205%20(Photobleaching%20Control).pdf" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

Visualizzazione a fluorescenza a singola molecola della dinamica della DNA polimerasi ai G-quadruplex

The ability of proteins&#160;involved in eukaryotic DNA replication to&#160;overcome obstacles &#8212; such as protein and DNA ...

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