Determinazione della morfologia mitocondriale in cellule vive mediante microscopia confocale
3 luglio 2025
In questo studio, descriviamo un protocollo passo-passo e sottolineiamo i dettagli chiave per determinare le caratteristiche morfologiche dei mitocondri nelle cellule vive, tra cui la preparazione del campione, l'acquisizione di immagini e l'analisi dei dati. Questo metodo è comunemente usato per esaminare la morfologia mitocondriale per studiare varie condizioni.
La nostra ricerca si concentra sulla neurofarmacologia di base. In particolare, studiamo come funzionano le molecole dei farmaci. Il nostro obiettivo è comprendere la relazione tra potenziali composti farmacologici e funzione mitocondriale nella malattia di Parkinson.
Studi precedenti esaminano le sfide di lunga data dell'analisi delle cellule di laboratorio, anche con le linee guida del produttore. Per risolvere questo problema, abbiamo delineato un protocollo dettagliato passo dopo passo per valutare la morfologia mitocondriale nelle cellule di laboratorio. Il nostro protocollo utilizza una semplice colorazione mitocondriale, imaging a fluorescenza e software open source.
Ciò riduce i costi, aumenta l'accessibilità e lo rende più facile da usare rispetto ad alternative complesse come la microscopia elettronica. Per iniziare, ottenere colture di cellule SH-SY5Y coltivate in fiasche contenenti DMEM/F12, integrate con il 10% di FBS. Staccare le cellule per un minuto utilizzando una soluzione di tripsina allo 0,05%.
Quindi centrifugare le celle a 100 G per tre minuti prima di passarle. Quindi, sospendere le cellule SH-SY5Y in terreno DMEM/F12 integrato con l'1% di FBS. Quindi seminare le cellule su piastre confocali con fondo di vetro e mantenerle per una notte.
Per la stimolazione MPP+, sostituire il terreno di coltura con terreno fresco con o senza 1-metil-4-fenilpiridinio per 24 ore. Per la colorazione MitoTracker, diluire la soluzione madre MitoTracker con terreno DMEM/F12 preriscaldato per ottenere una concentrazione di lavoro di 50 nanomolari. Mantenere la soluzione colorante al riparo dalla luce durante tutta la procedura.
Rimuovere il terreno di coltura dalle piastre confocali. Lavare le celle due volte con DMEM/F12 fresco. Quindi pipettare un millilitro della soluzione di lavoro MitoTracker nel piatto.
Incubare per 15 minuti a 37 gradi Celsius al buio. Ora rimuovi la soluzione di lavoro MitoTracker e lava i piatti due volte con DMEM/F12. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere un millilitro di DMEM/F12 a ogni piatto.
Incubare nell'incubatore cellulare prima dell'imaging. Per pre-equilibrare il microscopio confocale per l'imaging, sotto il pannello di acquisizione, regolare i parametri del percorso della luce impostando le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione. Imposta la dimensione del foro stenopeico su 1,2 unità ariose, la dimensione della scansione dei pixel su 1024 per 1024, il tempo di permanenza dei pixel su 2,4 microsecondi con una media di due.
Ora usa la luce alogena per mettere a fuoco le cellule utilizzando una lente obiettivo apocromatica 60X con un'apertura numerica di 1,4, riducendo al minimo la fototossicità. Regolare la potenza del laser e l'alta tensione appena al di sotto del livello di saturazione. Quindi imposta il fattore di zoom su tre e cattura le immagini.
Sposta la regione di interesse per mettere a fuoco altre cellule al microscopio. Quindi acquisisci le immagini senza modificare le impostazioni. Per migliorare la qualità dell'immagine prima della trasformazione binaria e dell'ossatura, aprire prima l'immagine.
Seleziona un'area di una singola cella utilizzando lo strumento ROI. Ora, fai clic in sequenza su processo, filtri, funzione maschera di contrasto per migliorare la nitidezza. Quindi utilizzare il processo e migliorare il contrasto per ridurre l'amplificazione del rumore.
Fare clic su processo, filtri e l'opzione mediana per rimuovere il rumore di sale e pepe. Per convertire l'immagine in binario, fai clic su processo seguito da binario e scegli l'opzione crea binario. Scheletrare l'immagine binaria facendo clic su elabora, binario e scheletra.
Quindi raggruppa tutti i pixel dello scheletro selezionando Analizza, seguito da Scheletro e analizza la funzione 2D 3D dello scheletro. Semplifica l'analisi utilizzando lo strumento MiNA per calcolare nove parametri descrittivi nell'immagine scheletrata. L'intensità della fluorescenza della colorazione mitocondriale è aumentata progressivamente con la concentrazione di CMXRos rosso MitoTracker da 25 nanomolari a 200 nanomolari.
Ma a 200 nanomolari, è stata osservata una sostanziale colorazione del fondo citoplasmatico. La morfologia mitocondriale è stata preservata meglio nel terreno DMEM/F12 rispetto al PBS a un'ora dopo la colorazione, sebbene DMEM/F12 abbia anche mostrato una maggiore fluorescenza di fondo. La media a doppio frame ha migliorato significativamente il rapporto segnale/rumore nell'imaging mitocondriale rispetto alla modalità a scansione singola.
E l'aumento del tempo di permanenza dei pixel da 2,4 a 10,8 microsecondi ha portato a immagini più luminose, ma ha causato il photobleaching. L'aumento dell'alta tensione ha intensificato il rumore di fondo, mentre l'aumento della potenza del laser ha portato al fotosbiancamento. Lo strumento MiNA ha prodotto output di scheletratura coerenti sia per le immagini scure che per quelle luminose, indicando una segmentazione robusta tra diverse intensità di fluorescenza, con l'immagine luminosa che mostra un'intensità 5,5 volte superiore rispetto all'immagine fioca.
Il trattamento MPP+ a 500 micromolari ha alterato la morfologia mitocondriale nelle cellule SH-SY5Y rispetto al controllo non trattato, con conseguente riduzione significativa dell'impronta mitocondriale.
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Panoramica
Questo studio presenta un protocollo dettagliato per valutare la morfologia mitocondriale in cellule SH-SY5Y vive, rilevante per studi farmacologici, specialmente nella malattia di Parkinson. Il metodo enfatizza l'accessibilità e i costi ridotti attraverso l'uso dell'imaging a fluorescenza con colorazione MitoTracker, evitando tecniche complesse come la microscopia elettronica.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neurofarmacologia
- Funzione mitocondriale
- Tecniche di imaging cellulare
Contesto
- Le sfide nell'analisi delle cellule di laboratorio persistono nonostante le indicazioni del produttore.
- Questo studio affronta queste problematiche delineando un protocollo passo-passo per la valutazione della morfologia mitocondriale.
- L'attenzione è rivolta alla riduzione dei costi e all'aumento dell'accessibilità per i ricercatori.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un metodo riproducibile per analizzare la morfologia mitocondriale in cellule vive.
- Facilitare la comprensione delle relazioni tra composti farmacologici e funzione mitocondriale in condizioni neurodegenerative.
- Confrontare l'efficacia di metodi di colorazione semplici con tecniche di imaging più complesse.
Metodi utilizzati
- La piattaforma principale utilizzata è la coltura cellulare viva.
- Le cellule di neuroblastoma SH-SY5Y sono impiegate come modello biologico per esaminare la risposta mitocondriale agli agenti farmacologici.
- L'acquisizione delle immagini coinvolge la microscopia a fluorescenza e software open-source per l'analisi dei dati.
- I passaggi chiave includono il distacco cellulare, la colorazione MitoTracker e le tecniche di elaborazione delle immagini come lo scheletrizzazione.
Principali risultati
- Il protocollo sviluppato consente una migliore visualizzazione e analisi della morfologia mitocondriale.
- Il trattamento con MPP+ ha mostrato di alterare significativamente la struttura mitocondriale nelle cellule trattate rispetto ai controlli.
- L'intensità della fluorescenza e il rumore di fondo sono fattori chiave nella qualità dell'imaging.
Conclusioni
- Questo studio stabilisce un approccio affidabile e a basso costo per l'imaging della morfologia mitocondriale nei neuroni vivi.
- Il metodo migliora la comprensione della dinamica mitocondriale nella risposta ai farmaci, in particolare nei modelli di malattie neurodegenerative.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of mitochondrial morphology in live cells is critical for mechanistic de-risking and target validation in neurodegenerative disease research. This confocal microscopy protocol enables reproducible, cost-effective evaluation of mitochondrial dynamics, supporting predictive confidence in early discovery and translational workflows. The approach facilitates robust comparison of compound effects on mitochondrial structure, directly informing portfolio triage and advancement decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of mitochondrial dynamics as a functional readout for target validation.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying morphological changes under pharmacological stress.
- Provides reproducible, quantitative data to inform predictive confidence in target engagement.
Screening & Assay Development
- Prepares validated live-cell systems for downstream phenotypic screening of mitochondrial modulators.
- Standardizes imaging and analysis parameters to ensure assay reproducibility and comparability.
- Generates quantitative morphological outputs suitable for compound evaluation and triage.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mitochondrial morphology metrics with disease-relevant cellular models for translational continuity.
- Enables risk-adjusted advancement by linking in vitro findings to preclinical endpoints.
- Facilitates biomarker development through robust morphological quantification.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies through lead identification and preclinical validation, supporting iterative hypothesis testing and data-driven decision-making.
- Discovery Biology: Quantifies mitochondrial morphology to clarify pathway effects and biological risk.
- Screening: Delivers standardized, reproducible imaging outputs for compound screening workflows.
- Analytics: Provides robust, quantitative morphological parameters for statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Bridges in vitro mitochondrial dynamics to disease-relevant phenotypes.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable platform for repeated use across diverse cell models and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in mitochondrial research.
- Operational Value: Standardizes live-cell imaging and analysis for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurodegenerative disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging and confocal microscopy operation.
- Needs access to fluorescence microscopes and open-source image analysis software.
- Demands cross-team standardization of staining, imaging, and analysis parameters.
- Adaptable to various cell models with protocol optimization for each system.
- Careful calibration is necessary to minimize photobleaching and background fluorescence.
