Preparato mitocondriale da microglia per l'analisi dei glicani

In generale, la nostra ricerca si concentra sulla determinazione del ruolo meccanicistico degli zuccheri, o glicani, e su come possiamo sfruttare quei percorsi di glicosilazione cellulare e subcellulare nell'invecchiamento e nei disturbi cerebrali. Attualmente, c'è una lacuna nella conoscenza del ruolo e della modulazione dei glicani subcellulari in diverse fisiopatologie della malattia, compresi i disturbi cerebrali acuti e cronici come l'ictus e l'Alzheimer. Questo protocollo e la nostra ricerca mirano a far progredire le conoscenze sul ruolo dei glicani nelle interazioni neuroimmunitarie e su come tali informazioni possano essere sfruttate per progettare terapie migliori ed efficienti per il sistema nervoso centrale.

[Narratore] Per iniziare, ottenere cellule microgliali BV-2 derivate da topi C57BL/6. Mantienili in DMEM a basso contenuto di glucosio integrato con il 10% di FBS, l'1% di penicillina streptomicina e l'1% di aminoacidi non essenziali. Far crescere le cellule in fiasche T175 fino a raggiungere la confluenza del 70-80%. Aspirare il fluido dal pallone. Risospendere il pellet cellulare in un millilitro di terreno di crescita. Usando il blu di tripano, conta le cellule. Centrifugare le cellule in una provetta da microcentrifuga da due millilitri a 500 G per cinque minuti. Aspirare con cura ed eliminare il surnatante. Aggiungere 800 microlitri di reagente di isolamento mitocondriale A e agitare a velocità media per cinque secondi. Quindi incubare la provetta con ghiaccio per due minuti esatti. Aggiungere 10 microlitri di reagente di isolamento mitocondriale B e agitare alla massima velocità per cinque secondi. Incubare su ghiaccio per cinque minuti, vorticando alla massima velocità ogni minuto. Ora aggiungi 800 microlitri di reagente di isolamento mitocondriale C e capovolgi la provetta per mescolare. E centrifugare a 700 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da due millilitri e centrifugare a 3.000 g per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire il surnatante contenente la porzione citosolica in una nuova provetta. Il pellet contiene i mitocondri isolati. Aggiungere 500 microlitri di reagente di isolamento mitocondriale C al pellet e centrifugare a 12.000 G per cinque minuti. Risospendere i mitocondri isolati in 50 microlitri di tampone di isolamento proteico. Lasciare la sospensione sul ghiaccio per 20 minuti. Aspirare ed erogare tre volte, e lasciare in ghiaccio per 20 minuti, vorticando prima dell'uso. Se non completamente solubilizzato, aggiungere altri 50 microlitri di tampone e accumulare nella stessa provetta. Centrifugare a 13.000 g per 10 minuti. Dopo aver recuperato e congelato il surnatante, asciugare con un concentratore sottovuoto. Per la rilevazione dei glicani rilasciati, risospendere i glicani essiccati e legati in 50 microlitri di acqua di grado LCMS. Pipettare cinque microlitri di glicani mitocondriali risospesi su un punto del campione su un vetrino per micropozzetti in teflon. Ionizzare e rilevare gli N-glicani in modalità di ionizzazione negativa utilizzando un solvente elettrospray costituito dal 60% di acetonitrile e un millimolare di acido acetico a una velocità di flusso di due microlitri al minuto e una tensione di 3,2 kilovolt. Accoppiare IR-MALDESI a uno spettrometro di massa HRAM impostato a una potenza risolutiva di 240.000 a tutta larghezza a metà del massimo con rapporto massa-carica 200 per analizzare tra 502.000 rapporto massa-carica in modalità di ionizzazione negativa. Identificare manualmente i glicani legati all'N cercando masse monoisotopiche. Confermare le distribuzioni isotopiche utilizzando la spaziatura massa-carica per determinare ioni doppiamente e triplicamente caricati con una soglia minima di flusso ionico di 1.000 ioni al secondo. Converti gli spettri di massa grezza per i rapporti massa/carica in masse monoisotopiche neutre. Quindi caricare le masse monoisotopiche su uno strumento di previsione della struttura degli oligosaccaridi online per determinare le potenziali composizioni dei glicani. Conferma le annotazioni utilizzando un database di glico curato sperimentalmente. Assicurarsi che ogni identificazione sia entro un margine di precisione di misurazione della massa di 2,5 parti per milione, contenga il nucleo e la struttura del glicano collegata ed escluda il pentoso, l'acido 3-deossi-d-manno-ott-2-ulosonico o i monosaccaridi dell'acido uronico. Le concentrazioni di proteine mitocondriali ottenute da sei preparazioni indipendenti non hanno mostrato variazioni significative, confermando un'elevata riproducibilità. L'analisi del sangue Western ha mostrato l'espressione di CoxIV solo nelle frazioni mitocondriali e di GAPDH solo nelle frazioni citoplasmatiche, confermando la purezza degli isolamenti mitocondriali e l'assenza di contaminazione non mitocondriale. Strutture distinte di N-glicani sialilati, fosforilati e solfatati sono state rilevate negli estratti mitocondriali utilizzando IR-MALDESI. Alti valori al quadrato che testano una bontà di adattamento hanno confermato la rilevazione di glicani legati all'N con uno e due addotti di cloro, confermando la rilevazione di queste composizioni di glicani utilizzando IR-MALDESI.