Name: Preparato mitocondriale da microglia per lanalisi dei glicani (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-30T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Scopri il protocollo per isolare mitocondri da cellule microgliali BV-2 e analizzare i glicani mediante spettrometria di massa IR-MALDESI. Questo metodo avanza la comprensione delle interazioni neuroimmunitarie.

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<ol><li>Dos Santos, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similar+microglial+cell+densities+across+brain+structures+and+mammalian+species%3A+Implications+for+brain+tissue+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Similar microglial cell densities across brain structures and mammalian species: Implications for brain tissue function.</a> J Neurosci. 40 (24), 4622-4643 (2020).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amersham 600 imager</td><td>Cytvia&nbsp;</td><td>29194217</td><td>Imager su gel e membrana</td></tr><tr><td>Countess 3 contatore di cellule automatizzato</td><td>Fisher Scientific</td><td>X003SZ1LY9</td><td></td></tr><tr><td>Dry Bath Stdrd 4 blck 100-120V</td><td>Thermofisher scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>88870003</tr><tr><td>i-Blot2 Dispositivo di trasferimento del gel</td><td>Invitrogen</td><td>IB21001</td><td>Sistema di trasferimento Western blot</td></tr><tr><td>Microscopio invertito</td><td>Cell Treat</td><td>04355223EA</td><td></td></tr><tr><td>Lettore</td><td></td> di micropiastre <td>82050-760</td><td></td></tr><tr><td>Mini serbatoio di gel</td><td>Invitrogen</td><td>A25977</td><td></td></tr><tr><td>Open Air Rocker</td><td>Fisher Marca</td><td>88861025</td><td></td></tr><tr><td>Pipet boy&nbsp;</td><td>BioTek</td><td>229310</td><td></td></tr><tr><td>Miscelatore a vortice</td><td>Integra- VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reagenti per l'isolamento dei mitocondri&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit di isolamento mitocondriale</td><td>Thermofisher scientific&nbsp;</td><td>89874</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della fosfotasi</td><td>Thermofisher scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>1861274</tr><tr><td>Inibitore della proteasi</td><td>Thermofisher scientific&nbsp;</td><td>1861281</td><td></td></tr><tr><td>N-glicano e reagenti IR-MALDESI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11350</td><td>50% in solvente ESI</td></tr><tr><td>Acetonitrile&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34851-4L</td><td>1 mM in solvente ESI</td></tr><tr><td>Bicarbonato di ammonio&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A643500</td> Soluzione di calibrazione <td>da 100 mM</td></tr><tr><td></td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A39239</td><td>Pierce FlexMix</td></tr><tr><td>Ditiotreitol&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>AC426380100</td><td>1 M</td></tr><tr><td>Iodoacetamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A322-10VL</td><td></td></tr><tr><td>Acqua di grado LC/MS</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>047146.M6</td><td></td></tr><tr><td>PNGase F</td><td>Bulldog Bio</td><td>NZPP010</td><td>75000 U/mL, enzima per il rilascio di N-glicano&nbsp;</td></tr><tr><td>N-glicano e materiali di consumo IR-MALDESI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtri centrifughi Amicon</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>UFC501024</td><td>Spettrometro di massa MWCO da 10 kDa</td></tr><tr><td></td><td>Orbitrap Exploris 240</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser a infrarossi medio</td><td>JGM Associates, Burlington, MA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vetrino per micropozzetti in teflon</td><td>Prosolia, Indianapolis, IN, USA</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>strong>Software di analisi degli N-glicani</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GlycoMod&nbsp;</td><td>Expasy&nbsp;</td><td></td><td>https://web.expasy.org/glycomod/</td></tr> <tr><td>GlyConnect</td><td>Expasy&nbsp;</td><td></td><td>https://glyconnect.expasy.org/</td></tr><tr><td>Isolamento proteico e materiali di consumo western blot&nbsp; Punte di caricamento del gel </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Basix ( 10 & micro; L)&nbsp;</td><td>Basix</td><td>13-611-102</td><td></td></tr><tr><td>Basix gel caricatori ( 200 &micro; L)&nbsp;</td><td>Basix</td><td>13-611-116</td><td></td></tr><tr><td>Raschiatore di celle</td><td>VWR labs</td><td>14-388-100</td><td></td></tr><tr><td>i-Blot NC pile regolari</td><td>Invitrogen</td><td>IB23001</td><td></td></tr><tr><td>i-Blot2 PVDF pile regolari</td><td>Invitrogen</td><td>IB24001</td><td></td></tr><tr><td>10&nbsp; &micro; micropipetta a L</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBE00010</td><td></td></tr><tr><td>20 &micro; Micropipetta L</td><td>Invitrogen</td><td>FBE00020</td><td></td></tr><tr><td>200&nbsp; &micro; L micropipetta&nbsp;</td><td>Fisher Marca</td><td>FBE00200</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro; Micropipetta L</td><td>marca Fisher</td><td>FBE01000</td><td></td></tr><tr><td>10&nbsp; &micro; L puntali per pipetta&nbsp;</td><td>VWR labs</td><td>76322-528</td><td></td></tr><tr><td>20&nbsp; &micro; L puntali per pipette</td><td>VWR labs</td><td>76322-134</td><td></td></tr><tr><td>200&nbsp; &micro; L puntali per pipetta&nbsp;</td><td>Laboratori VWR</td><td>76322-150</td><td></td></tr><tr><td>1000&nbsp; &micro; L puntali per pipette</td><td>VWR labs</td><td>76322-154</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a pozzetti&nbsp;</td><td>Fisher marca</td><td>14-388-100</td><td></td></tr><tr><td>Isolamento proteico e reagenti western blot&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo actina (ospite: coniglio)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>8457T</td><td></td></tr><tr><td>Anti-coniglio IgG HRP collegato&nbsp;</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>7074S</td><td></td></tr><tr><td>Bolt 4-12% Bis-Tris Plus</td><td>Invitrogen</td><td>NW04120BOX</td><td></td></tr><tr><td>Bioreagenti Fisher per</td><td>siero bovino anticorpi</td><td>BP9700-100</td><td></td></tr><tr><td>COXIV (ospite: coniglio)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>4844S</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH anticorpo (ospite: coniglio)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>2118S</td><td></td></tr><tr><td>Kit per il dosaggio delle proteine MicroBCA</td><td>Thermofisher scientific&nbsp;</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Nupage MOPS SDS Runing Buffer [20x]</td><td>Thermofisher scientific&nbsp;</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>PAGE Righello scala proteica predisposta</td><td>Thermofisher scientific&nbsp;</td><td>815-968-0747</td><td>Diluizione= Utilizzare 7&nbsp; &micro; L per caricare sul primo pozzetto</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato&nbsp;</td><td>Aniara Diagnostics</td><td>A12-9423-5</td><td>Prepara 1x PBS da 10x polvere&nbsp;</td></tr><tr><td>Pierce ECL Western Blotting Substrato</td><td>Thermofisher scientifico&nbsp;</td><td>32106</td><td>Kit substrato chemiluminescente</td></tr><tr><td>RIPA Buffer</td><td>Thermofisher scientific&nbsp;</td><td>89901</td><td></td></tr><tr><td>Tampone per campioni</td><td>Novex</td><td>B0007</td><td>Il tampone per campioni LDS a bullone è preparato in rapporto 3:1 tra campione e tampone</td></tr><tr><td>per campioni Tween-20</td><td>MP Biomedicals</td><td>TWEEN201</td><td></td></tr><tr><td>Materiali di consumo per colture tissutali&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Countess Slides</td><td>Avantor</td><td>229411</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf provette</td><td>Cell Treat</td><td>414004-265612-5884</td><td></td></tr><tr><td>pipetta aspirante da 2 mL</td><td>Vista lab</td><td>5090-0010E</td><td></td></tr><tr><td>pipetta sierologica da 5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta sierologica da 10 mL</td><td>Basix</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta sierologica da 25 mL</td><td>Vista lab</td><td>FB012937</td><td></td></tr><tr><td>pipetta sierologica da 50 mL</td><td>Vista lab</td><td>14955233</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Provetta conica</td><td>Avantor</td><td>229225A</td><td></td></tr><tr><td>Provetta conica da 50 mL</td><td>Cell treat</td><td>4190-0050</td><td></td></tr><tr><td>T-75 cm2 Pallone per coltura tissutale</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>FB012937</tr><tr><td>T-180 cm2 Pallone per colture tissutali</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012939</td><td></td></tr><tr><td>Reagenti per colture tissutali&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BV2 linea cellulare microgliale&nbsp;</td><td>Bioarray creativo&nbsp;</td><td>CSC-I2227Z</td><td>Microglia di topo immortalizzata (BV2) derivata dalla microglia neonatale C57/BL6</td></tr><tr><td>Enzimi di dissociazione cellulare&nbsp;</td><td>Thermofisher scientifico&nbsp;</td><td>12563029</td><td>TrypLE&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Terreni a basso contenuto di glucosio</td><td>Gibco</td><td>10567014</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Cytiva</td><td>SH30071.03HI</td><td></td></tr><tr><td>Terreno essenziale minimo (MEM) Aminoacidi non essenziali</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Penicillium Streptomycin</td><td>Cytivia</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Tampone fosfato soluzione salina</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue colorante 0,4%</td> <td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr></tbody></table>

preparato mitocondriale da microglia per l'analisi dei glicani

Mitochondrial Preparation from Microglia for Glycan Analysis

La Figura 1 rappresenta uno schema schematico delle fasi coinvolte nell'isolamento dei mitocondri dalla linea cellulare microgliale BV2 per l'analisi spettrometrica di massa dei glicani. La riproducibilità dell'isolamento delle proteine mitocondriali tra diverse preparazioni mitocondriali dalla stessa densità iniziale delle cellule microgliali è rappresentata nella Figura 2, che non mostra differenze significative tra la concentrazione di proteine mitocondriali ...

Preparato mitocondriale da microglia per l'analisi dei glicani

Understanding the glycosylation patterns of mitochondrial proteins in microglia is critical for determining their role in neurodegenerative diseases. ...

mitochondrial-preparation-from-microglia-for-glycan-analysis

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Isolamento microglia primaria dalla eterogeneità cellulare del cervello è essenziale per studiare il loro ruolo sia in condizioni fisiologiche e patologiche. Questo protocollo descrive un isolamento meccanico e mista tecnica di coltura cellulare che fornisce alta resa ed elevata purezza, cellule vitali primarie per...

Isolamento primario Microglia misti da colture cellulari gliali del tessuto neonatale cervello di ratto

Microglia risiedono macrofagi che forniscono la prima linea di difesa e sorveglianza immunitaria del sistema nervoso centrale. I microRNA sono molecole regolatrici che svolgono un ruolo importante in molti processi fisiologici tra cui l'attivazione e la differenziazione dei macrofagi. In questo articolo, si descrive il metodo per la misurazione dei microRNA in cellule microgliali.

Rilevamento dei microRNA nella microglia da Real-time PCR in CNS normale e durante neuroinfiammazione

Il video dimostra una tecnica per isolare la microglia dalla corteccia del cervello di un topo adulto. In primo luogo, la corteccia subisce la segmentazione e l'omogeneizzazione per rimuovere i neuroni e altre cellule gliali, preservando la microglia. Successivamente, la sospensione cellulare viene esposta a microsfere magnetiche anti-mielina e a un campo magnetico, separando efficacemente le microglia e le cellule mieloidi dai detriti di mielina e dalle cellule contenenti mielina.

Isolamento della microglia dalla corteccia di un cervello di topo adulto

Questa procedura illustra come isolare dal cervello di topo adulto i mitocondri associate membrane ER o MAMS e glicosfingolipidi-arricchiti frazioni microdomini di MAMs e preparati mitocondriali.

I mitocondri associati Membrane ER (MAMs) e glicosfingolipidi microdomini arricchiti (GEM): Isolamento dal cervello di topo

Noi descriviamo i metodi per l'efficiente e rapido isolamento / cultura della microglia praticabile dalla corteccia cerebrale neonatale e midollo spinale adulto. La dissezione e la placcatura di microglia corticale può essere realizzato entro 90 minuti, con la conseguente raccolta microglia in atto ~ 10 giorni dopo la dissezione iniziale.

Coltura Microglia dal Sistema Nervoso Centrale neonatale e adulti

Una chiave per il successo indagini di biologia microglia è la conservazione dei immunofunction microglia ex vivo durante l'isolamento dal tessuto del sistema nervoso centrale. Isolare microglia via rotanti risultati si stringono in colture cellulari altamente puri e immunofunctional come valutato da immagini fluorescenti, immunocitochimica, ed ELISA dopo l'attivazione della microglia con il lipopolisaccaride stimoli pro-infiammatori (LPS) e Pam 3 CSK 4 (Pam).

Isolamento della corticale Microglia con Immunofenotipo conservato e funzionalità dal murini neonati

Qui, un protocollo (MitoCeption) viene presentato per trasferire i mitocondri, isolato dalle cellule staminali mesenchimali umane (MSC), alle cellule staminali di glioblastoma (GSC), con l'obiettivo di studiare i loro effetti biologici sul metabolismo e le funzioni di GSC. Un protocollo simile può essere atto a trasferire mitocondri tra altri tipi di cellule.

MitoCeption: Trasferimento isolato umana MSC mitocondri di Glioblastoma cellule staminali

Fornito qui è un protocollo per studiare le interazioni tra forma nativa, prefibrillare, e fibrille amiloidi mature di diversi peptidi e proteine con mitocondri isolati da diversi tessuti e varie aree del cervello.

Interazioni con e Membrana Permeabilizzazione di mitocondri cerebrali di Amyloid Fibrils

Forniamo un protocollo per l'isolamento della microglia da diverse regioni sezionate di un emisfero cerebrale adulto, seguito dalla preparazione della libreria semiautomatica per il sequenziamento profondo dell'RNA unicellulare di trascrittomi a lunghezza intera. Questo metodo aiuterà a chiarire l'eterogeneità funzionale della microglia in salute e malattia.

Isolamento di Microglia specifico della regione da un emisfero cerebrale di topi adulto per il sequenziamento profondo dell'RNA a singola cellula

Questo studio presenta un metodo per analizzare la morfologia dei mitocondri basato sull'immunocolorazione e l'analisi delle immagini nel tessuto cerebrale di topo in situ. Descrive anche come questo consenta di rilevare i cambiamenti nella morfologia mitocondriale indotti dall'aggregazione proteica nei modelli di malattia di Parkinson.

Esame istologico della morfologia mitocondriale in un modello di malattia di Parkinson

Questo protocollo descrive un modo conveniente per eseguire un test di sforzo per la glicolisi al fine di quantificare la riprogrammazione metabolica nella microglia primaria del topo. Dopo l'isolamento e la stimolazione infiammatoria, il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) viene misurato utilizzando reagenti appena preparati e regolati per il pH, seguiti dalla normalizzazione proteica per consentire una valutazione accurata e riproducibile degli spostamenti glicolitici.

Indagine della glicolisi nella microglia primaria tramite test di flusso extracellulare

Scopri il protocollo per isolare mitocondri da cellule microgliali BV-2 e analizzare i glicani mediante spettrometria di massa IR-MALDESI. Questo metodo avanza la comprensione delle interazioni neuroimmunitarie.

Preparato mitocondriale da microglia per l'analisi dei glicani

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