Imaging rapido ad alta risoluzione a montaggio intero della vascolarizzazione di piccoli animali per studi quantitativi

Lavoriamo per comprendere i meccanismi di formazione della malattia, in particolare i difetti cardiaci congeniti e se i cambiamenti nel flusso emodinamico contribuiscono o aggravano la formazione della malattia. La tomografia nanocomputerizzata, la risonanza magnetica per piccoli animali, l'ecografia 4D e la demografia a coerenza ottica sono tutte utilizzate per raccogliere scansioni di imaging quantitativo ad alta risoluzione per la modellazione computazionale.

Il nostro protocollo risponde all'esigenza di una tecnica di imaging vascolare quantitativo rapida e facilmente accessibile che possa essere applicata a una varietà di modelli animali, compresi i loro embrioni e organi. Il nostro protocollo è efficiente in termini di tempo, con tempi di preparazione dei campioni da quattro settimane a soli tre giorni. Utilizza composti di chiarificazione pericolosi minimi e non si basa su marcatori vascolari che non sono presenti negli embrioni precoci.

Ora che abbiamo stabilito una tecnica per raccogliere regolarmente scansioni volumetriche ad alta risoluzione e specifiche per soggetto, possiamo concentrarci sulla creazione di nuovi modelli di malattia derivanti da perturbazioni genetiche e meccaniche.

[Narratore] Per iniziare, posizionare l'embrione aviario, che va dallo stadio 18 di Hamburger Hamilton allo stadio 34 sotto uno stereoscopio o su un tavolo di dissezione. Taglia intorno all'embrione dal tuorlo d'uovo usando le forbici a punta curva, quindi usando una pipetta di trasferimento o una spatola, trasferisci l'embrione in una capsula di Petri da 35 millimetri riempita con una soluzione calda di Tyrode. Sotto lo stereoscopio, utilizzando una pinza a punta sottile, praticare incisioni di circa 0,1 millimetri nelle membrane per rimuovere il corion e il Lantus che coprono l'embrione. Tirare via delicatamente le membrane, insieme alla membrana pericardica che circonda il cuore. Trasferisci l'embrione in una nuova capsula di Petri pulita riempita con la soluzione calda di Tyrode per mantenere l'attività cardiaca. Ora, riempi una siringa di plastica da cinque millilitri con la soluzione calda di Tyrode. Tagliare l'estremità larga di un puntale per pipetta in plastica da 20 microlitri e fissarlo saldamente all'estremità piatta della siringa. Per costruire una linea di iniezione, collegare un segmento di tubo in silicone con diametro interno di 0,03 pollici al gruppo siringa della punta della pipetta, seguito da un microago capillare di vetro all'estremità opposta del tubo. Quindi montare il microago sul supporto per microiniezione, collegato a un micro-manipolatore, ed eliminare tutte le bolle d'aria dal tubo in silicone e dal microago. Usando il micro manipolatore, inserire il microago nell'apice del cuore e iniettare lentamente la soluzione di Tyrode per perfondere l'embrione. Successivamente, utilizzare il micro-manipolatore per ritrarre la linea di iniezione e riorientare il microago in modo che rimanga stabile durante le ulteriori preparazioni. Quindi staccare il tubo di silicone sia dall'ago che dalla siringa. Preparati per l'endoteggio per etichettare l'endotelio vascolare con fluorescenza verde. Utilizzando una micropipetta, caricare da 20 a 40 microlitri di soluzione madre di poli-L-lisina FITC nel tubo di silicone. Ricollegare la siringa piena di soluzione di Tyrode e, utilizzando il micromanipolatore, iniettare lentamente la soluzione nell'apice del cuore, reinserendo l'ago se necessario. Quindi rimuovere l'ago dopo che FITC Poly-L-Lysine si è diffuso, assicurandosi che non entrino bolle d'aria nel cuore. Lasciare che la poli-L-lisina FITC rimanga nell'embrione per 5-10 minuti. Quindi riempire una siringa da cinque millilitri con paraformaldeide al 4% e collegarla al tubo di iniezione in silicone per prepararsi a una terza fase di iniezione. Perfondere l'embrione con il 4% di paraformaldeide fino a quando le strutture cardiovascolari sono completamente riempite e il tessuto diventa più opaco. Posizionare delicatamente l'embrione in una fiala da due a cinque millilitri, riempita con una quantità di paraformaldeide al 4% sufficiente per immergere il campione e incubarlo per una notte a quattro gradi Celsius in uno shaker. Pipettare con cautela l'aldeide paraforme al 4% dal flaconcino. Aggiungere PBS fresco all'embrione e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti, agitando delicatamente per lavare il campione. Per disidratare l'embrione, metterlo sotto una cappa aspirante e pipettare con cura il PBS. Incubare l'embrione in sequenza in una serie graduata di concentrazioni di metanolo per un'ora ciascuna a temperatura ambiente. Quindi incubare l'embrione in metanolo fresco al 100% per una notte a temperatura ambiente. Per rimuovere i lipidi, aggiungere all'embrione una soluzione da due a uno in volume di diclorometano a metanolo. E incubare per tre ore agitando delicatamente a temperatura ambiente. Togliere l'etilcinnamato dalla refrigerazione a quattro gradi Celsius e lasciarlo scongelare a temperatura ambiente. Lavare l'embrione in diclorometano fresco al 100% a temperatura ambiente per 15 minuti agitando. Rimuovere il diclorometano con una pipetta e incubare l'embrione in cinnamato di etile al 100% fino a quando l'embrione non si libera, il che richiede circa un'ora. Montare il capillare di vetro sul portacampioni e riempire la camera di imaging con cinnamato di etile. Ora, abbassa delicatamente l'embrione nella camera. Regola i parametri di imaging in base alle specifiche ed esegui l'imaging a foglio leggero. Crea un nuovo progetto SV in File e carica uno stack di imaging light sheet ad alta risoluzione dopo aver fatto clic con il pulsante destro del mouse su Immagini e aver selezionato Aggiungi o Sostituisci immagine. Per creare una linea di percorso, fare clic con il pulsante destro del mouse su Percorsi e selezionare Crea percorso. Posiziona i marcatori di percorso lungo un recipiente di interesse e ripeti questo processo per ogni recipiente da analizzare. Per ogni linea del percorso, fare clic con il pulsante destro del mouse su Segmentazioni e selezionare Crea gruppo di curve di livello per iniziare la segmentazione. Selezionare il percorso dell'imbarcazione e fare doppio clic sul nome dell'imbarcazione in Segmentazione per avviare la segmentazione manuale delle sezioni trasversali 2D. Dopo aver segmentato tutte le imbarcazioni, fare clic con il pulsante destro del mouse su Modelli e scegliere Crea modello. Infine, seleziona il tipo PolyData, inserisci un nome per il modello, fai clic su Crea modello solido e seleziona tutte le segmentazioni pertinenti. Utilizzando il protocollo di imaging ottimizzato, sono stati ottenuti lumi dei vasi chiaramente delineati in diversi stadi embrionali, rivelando le arterie dell'arco faringeo, l'aorta dorsale e le strutture cardiache come ventricoli e atri in fluorescenza verde, La microscopia a fluorescenza a foglio di luce consente una ricostruzione 3D dettagliata del tratto di efflusso, delle arterie dell'arco faringeo e dell'aorta dorsale, consentendo viste in sezione trasversale e risolte in profondità dell'anatomia vascolare. La pulizia ottica degli embrioni ha migliorato significativamente la visibilità della vascolarizzazione interna sotto fluorescenza, in particolare nel canale GFP dove i vasi marcati sono diventati più distinti dopo la pulizia. Le ricostruzioni anatomiche e le simulazioni computazionali delle arterie dell'arco faringeo dell'embrione di pollo del quinto giorno hanno rivelato percorsi distinti del flusso sanguigno verso le regioni craniche e caudali e hanno mostrato valori di stress di taglio della parete di picco allineati con precedenti studi di tomografia nano-computerizzata.