Identificazione delle specie di Mycobacterium mediante il metodo del chip DNA Microarray

[Narratore] Questa ricerca si concentra sulla diagnostica molecolare in microbiologia clinica. Rispetto ai metodi di rilevamento tradizionali, il metodo del chip DNA microarray per l'identificazione delle specie di mycobacterium è altamente sensibile, specifico e rapido, il che può fornire un aiuto importante per la diagnosi precoce dei pazienti clinici. Attualmente, i metodi di identificazione rapida dei micobatteri non tubercolari sono limitati in molti laboratori di base, che hanno un impatto diretto sulla diagnosi clinica e sul trattamento dei pazienti. Per iniziare, impostare la temperatura del bagnomaria a temperatura costante a 50 gradi Celsius e preriscaldarlo. Per preparare le patatine, aggiungere 200 microlitri di acqua distillata sul fondo della scatola di ibridazione del chip del microarray genetico. Posizionare la staffa tra le due colonne di posizionamento all'interno della scatola. Posiziona con cura il chip con il lato anteriore rivolto verso l'alto sulla staffa e coprilo con il vetrino coprioggetti in modo che le quattro sporgenze siano rivolte verso il basso, assicurandoti che l'estremità del vetrino coprioggetti sia allineata con l'etichetta all'estremità del chip. Successivamente, preparare provette da centrifuga da 200 microlitri o otto strisce di pozzetti in base al numero di campioni ed etichettarle correttamente. Riscaldare il tampone di ibridazione del kit a 50 gradi Celsius fino a quando non è completamente sciolto. Dopo un'accurata miscelazione, centrifugarlo rapidamente in una microcentrifuga. Aliquotare nove microlitri di tampone di ibridazione in ogni provetta o striscia preparata. Aggiungere sei microlitri del prodotto PCR corrispondente a ciascuna provetta, ottenendo un volume finale di 15 microlitri per miscela di reazione. Riscaldare la miscela di reazione di ibridazione a 95 gradi Celsius per cinque minuti per denaturarla utilizzando uno strumento PCR o un bagno d'acqua. Dopo il trattamento di denaturazione, immergere immediatamente la miscela in una miscela di acqua ghiacciata e incubare per tre minuti. Rimuovere la miscela di reazione di ibridazione dal bagno di ghiaccio e mescolarla pipettandola due volte su e giù. Quando non rimane precipitato di flocculante bianco, aggiungere 13,5 microlitri della miscela di reazione attraverso il foro di caricamento del vetrino coprioggetti. Copri e sigilla rapidamente la scatola di ibridazione e registra il numero del chip, la posizione del microarray e il numero del campione. Ora, posiziona le scatole di ibridazione sigillate orizzontalmente nel bagno d'acqua a temperatura costante che è stato preriscaldato a 50 gradi Celsius. Dopo aver posizionato tutte le scatole all'interno, avvia il timer per 120 minuti. Al termine della reazione di ibridazione, estrarre le scatole di ibridazione orizzontalmente, smontarle e recuperare i chip. Posizionare immediatamente le patatine sulla griglia per vetrini all'interno di un contenitore riempito con la soluzione di lavaggio dei trucioli I che è stata bilanciata a temperatura ambiente e lavarle a 80-100 giri/min su un agitatore a temperatura costante per tre minuti a temperatura ambiente. Lavare nuovamente le patatine con la Chip Washing Solution II sullo shaker impostato su 80-100 giri/min per tre minuti a temperatura ambiente. A questo punto, mettete le patatine in una centrifuga e fatele girare a 100 g per cinque minuti a temperatura ambiente. Accendere lo scanner. E poi apri il software corrispondente. Fare clic sul pulsante Controllo laser per consentirne il preriscaldamento per 10 minuti. Inserire le informazioni relative al campione nel software. Al termine del preriscaldamento dello scanner, fare clic sul pulsante Espelli. Posizionare costantemente il chip essiccato sul piccolo pezzo della staffa. Spingere delicatamente e orizzontalmente il chip nello scomparto dello scanner e fare clic sul pulsante Carica. Ora, inserisci il numero del chip nel software e fai clic per selezionare l'area di rilevamento da 1 a 4 del microarray. Fare clic su Seleziona campione per scegliere i campioni corrispondenti per ciascun microarray. Quindi fare clic su Avvia rilevamento per avviare la scansione del chip. I risultati della scansione verranno visualizzati sullo schermo e salvati automaticamente. Utilizzare la pagina di query dei dati per eseguire query sui dati e operazioni di stampa. Dopo aver completato tutte le operazioni, spegnere il laser, uscire dal software e, infine, spegnere lo scanner. La validità dei risultati sperimentali è confermata dal controllo di qualità, con il controllo positivo che produce un risultato di rilevamento del complesso mycobacterium tuberculosis e il controllo negativo che non produce alcun mycobacterium. L'interpretazione dei campioni di prova inizia con i casi in cui tutte le sonde, compresa quella con il valore di segnale più alto, sono negative, risultando in una segnalazione di assenza di micobatterio. Nei campioni in cui solo la sonda del complesso mycobacterium tuberculosis mostra un segnale forte, il risultato viene identificato come positivo per quel gruppo di specie. Se la sonda corrispondente al mycobacterium avium è l'unica con un segnale forte, il campione viene identificato come positivo per il mycobacterium avium. Se solo la sonda di controllo interno è positiva e tutte le altre sono negative, il risultato viene riportato come indeterminato, indicando la presenza di una specie di micobatterio non coperta dal kit di rilevamento.