Name: Citometria intracellulare a fosfoflusso di pazienti con leucemia mieloide acuta Xenotrapianti derivati da pazienti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-06T15:35:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Impara la citometria intracellulare a fosfoflusso per analizzare le vie di segnalazione mTORC1, JAK/STAT5 e MAPK nelle cellule di leucemia mieloide acuta xenotrapiantate. Questo metodo offre informazioni preziose per lo sviluppo di terapie mirate contro il cancro.

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<li>Song, P., Yang, F., Jin, H., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+protein+translation+and+its+implications+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">The regulation of protein translation and its implications for cancer.</a> Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 68(2021).</li>
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 <a target="_blank" href="https://www.mcgill.ca/research/files/research/110-mouse_anesthesia-2024-06-17.pdf">https://www.mcgill.ca/research/files/research/110-mouse_anesthesia-2024-06-17.pdf</a> (2024).</li>
<li>Tech Team Tips: Preparing a Sample with AO/PI. , DeNovix. 
 <a target="_blank" href="https://www.denovix.com/webinars/tech-team-tips-preparing-a-sample-with-ao-pi">https://www.denovix.com/webinars/tech-team-tips-preparing-a-sample-with-ao-pi</a> (2021).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>Siringhe da 1 mL 25G x 5/8 TW&nbsp;</td><td>BD Bioscienze</td><td>#309626</td><td>Siringhe per aspirazione di midollo osseo</td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga da 1,7 mL</td><td>FroggaBio</td><td>#LMCT1,7 miliardi</td><td>Aliquotare le cellule recuperate mediante aspirazione del midollo osseo</td></tr><tr><td>BD Horizon Brilliant Stain Buffer</td><td>BD Bioscienze</td><td>#563794</td><td>Per i processi di colorazione</td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Fidelis Salute Animale</td><td>Ethiqa XR</td><td>Analgesia per topi</td></tr><tr><td>CellDrop FL Illimitato</td><td>FroggaBio</td><td>#CellDrop FL- UNLTD</td><td>Per il conteggio delle celle</td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Wisent Inc.</td><td>#311-425-CL</td><td>Terreni per il recupero di cellule mediante aspirazione del midollo osseo</td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5427 R</td><td>Millipore Sigma</td><td>#EP5429000260</td><td></td></tr><tr><td>Fetale Siero Bovino Inattivato dal Calore Premium CA</td><td>Wisent Inc.</td><td>#090-450</td><td>Per i processi di colorazione</td></tr><tr><td>Soluzione di formaldeide</td><td>Millipore Sigma</td><td>#F1635</td><td>Permeabilizzazione cellulare</td></tr><tr><td>umanoAnticorpo CD45 [HI30]&nbsp;</td><td>BD Bioscienze</td><td>#563792</td><td>Anticorpo accoppiato con BUV395</td></tr><tr><td>Analizzatore di cellule spettrali ID7000</td><td>Sony</td><td></td><td>Analizzatore di citometro a flusso spettrale</td></tr><tr><td>Isoflurano 99,9% liquido</td><td>Mckesson</td><td>#803250</td><td>Anestesia per topi</td></tr><tr><td>Isospire (isoflurano) Anestetico per inalazione</td><td>Dechra</td><td></td><td>Anestesia per topi</td></tr><tr><td>Vivo/morto AO/PI</td><td>FroggaBio</td><td>CD-AO/PI-1.5</td><td>Per il conteggio delle celle</td></tr><tr><td>Zombie NIR vivo/morto</td><td>BioLegend+B6:C12</td><td>#423106</td><td>Per citometria a flusso spettrale</td></tr><tr><td>Soluzione di metanolo</td><td>Millipore Sigma</td><td>#179957</td><td>Fissazione delle cellule</td></tr><tr><td>Anticorpo P-4EBP1 (Thr37/46) [236B4]</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare</td><td>#2846</td><td>Anticorpo accoppiato con Alexa Fluor 488</td></tr><tr><td>p-Erk1/2 (Thr202/Tyr204) [197G2] anticorpo</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare</td><td>#13148</td><td>Anticorpo accoppiato con Alexa Fluor 647</td></tr><tr><td>anticorpo p-RPS6 (Ser240/244) [D68F8]</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare</td><td>#9468</td><td>Anticorpo accoppiato con Alexa Fluor 594</td></tr><tr><td>anticorpo p-STAT5 (Tyr694) [D47E7]</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare</td><td>#14603</td><td>Anticorpo accoppiato con PE</td></tr><tr><td>Controllo IgG di coniglio [DA1E]</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare</td><td>#2975</td><td>Anticorpo accoppiato con Alexa Fluor 488</td></tr><tr><td>Controllo IgG di coniglio [DA1E]</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare</td><td>#2985</td><td>Anticorpo accoppiato con Alexa Fluor 647</td></tr><tr><td>Controllo IgG di coniglio [DA1E]</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare</td><td>#8760</td><td>Anticorpo accoppiato con Alexa Fluor 594</td></tr><tr><td>Controllo IgG di coniglio [DA1E]</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare</td><td>#5742S</td><td>Anticorpo accoppiato con PE</td></tr><tr><td>Salviette igienizzanti</td><td>Canada Unito</td><td>#UCDWPR-9022</td><td>Disinfezione per aspirazione di midollo osseo</td></tr></tbody></table>

citometria intracellulare a fosfoflusso di pazienti con leucemia mieloide acuta xenotrapianti derivati da pazienti

Intracellular Phosphoflow Cytometry of Acute Myeloid Leukemia Patient-Derived Xenotransplants

Il disegno sperimentale mira a monitorare lo stato di fosforilazione di proteine selezionate di interesse in diversi punti temporali, ad esempio 1 giorno prima dell'inizio del trattamento e 15 giorni dopo l'inizio del trattamento. Questa linea di base funge da controllo critico per verificare la veridicità dei successivi cambiamenti nell'attivazione della via di segnalazione dopo il trattamento. Dopo quindici giorni di trattamento, viene eseguito un secondo confronto per valutare la modulazione del percorso nei topi trattati rispetto ai controlli trattati con veicolo (Figura 4). Questo approccio in due fasi consente di distinguere gli effetti indotti dal trattamento dalla variabilità basale.
Per questo studio è stato utilizzato un modello murino AML PDX. I topi sono stati trapiantati con cellule AML derivate da pazienti caratterizzate dalle seguenti mutazioni: DNMT3AMR882H con una frazione allelica variante (VAF) del 48%, NPM1W288fs VAF 36%, FLT3ITD VAF 10% e IDH2R140Q VAF 44%. Dopo il trapianto, sono state concesse tre settimane per la crescita del tumore prima di iniziare il trattamento. I topi PDX trapiantati con mutazione FLT3 sono stati trattati per quindici giorni con uno dei tre regimi: placebo, gilteritinib (15 mg/kg al giorno) o una combinazione di venetoclax (50 mg/kg al giorno), 5-azacitidina (2,5 mg/kg al giorno) e cedarizudina (3 mg/kg al giorno) (Figura 4A).
Per quanto riguarda i risultati ottenuti, è degno di nota menzionare che il trattamento con un regime a base di venetoclax ha portato a un aumento significativo della fosforilazione di STAT5 e RPS6, suggerendo che queste vie contribuiscono alla resistenza alla terapia (Figura 4E). Al contrario, gilteritinib, un farmaco che ha come bersaglio FLT3, non ha ridotto lo stato di fosforilazione degli effettori FLT3 mutanti. È possibile che nel campione di LMA testato, la presenza di ulteriori mutazioni secondarie diverse da FLT3-ITD (ad esempio, IDH2) contribuisca all'attivazione di queste vie o che il trattamento farmacologico nell'arco di due settimane porti all'eliminazione selettiva delle cellule AML con diminuzione della segnalazione. Poiché tutte le fosfoproteine analizzate provengono dalla stessa popolazione cellulare, è possibile confrontare l'attivazione delle fosfoproteine. In questo esperimento, la correlazione più forte nella colorazione delle fosfoproteine sembra essere tra p-STAT5 e p-RPS6 (Figura 1A supplementare), che sono entrambe sovraregolate in questo gruppo sperimentale dopo il trattamento (Figura 4E). Sembra esserci una minore relazione tra p-STAT5 e p-ERK (Figura supplementare 1B). È importante sottolineare che la dimensione delle cellule (valutata utilizzando FSC-A) non è un fattore determinante per la positività complessiva di p-STAT5, evidenziando che la positività alla colorazione non è semplicemente un prodotto delle dimensioni delle cellule (Figura 1C supplementare). Questo quadro sperimentale consente una valutazione completa degli effetti di questi trattamenti sulla modulazione della via di segnalazione.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68244/68244fig01.jpg"> 
Figura 1: Visualizzazione delle vie di segnalazione target e della strategia per la loro analisi. (A) Panoramica delle vie di segnalazione che coinvolgono p-STAT5 (Tyr694), p-4EBP1 (Thr37/46), p-RPS6 (Ser240/244) e p-ERK1/2 (Thr202/Tyr204). Nella via p-STAT5, JAK subisce autofosforilazione, aumentando la sua attività catalitica, quindi fosforila specifici residui di tirosina, creando siti di aggancio per le proteine STAT. STAT5 fosforilato (Tyr694) omodimerizza e trasloca nel nucleo, dove si lega a specifici elementi sensibili a STAT nelle regioni promotrici dei geni bersaglio. Nella cascata RAS-RAF-MEK-ERK, l'autofosforilazione del recettore FLT3 o di altre tirosin-chinasi recettoriali (RTK) in seguito al legame del ligando porta allo scambio di GDP per GTP su RAS, attivando così RAS. Il RAS-GTP attivato recluta RAF nella membrana plasmatica, dove RAF subisce un cambiamento conformazionale e diventa attivo. RAF quindi fosforila e attiva MEK1/2, una chinasi a doppia specificità, che a sua volta fosforila ERK ai residui di Thr202/Tyr204. ERK1/2 attivato trasloca nel nucleo, dove fosforila specifici fattori di trascrizione. ERK1/2 è anche in grado, attraverso vie di segnalazione intermedie, di aumentare l'attività di mTORC1 e di fosforilare eIF4E in siti specifici per aumentare l'attività di traduzione. Attivato da nutrienti e fattori di crescita attraverso FLT3 e altri RTK, mTORC1 fosforila bersagli a valle come S6K1 e 4E-BP1. S6K1, a sua volta, fosforila RPS6, che migliora la funzione dei ribosomi e attiva la traduzione. L'iperfosforilazione di 4E-BP1 rilascia eIF4E, consentendo l'assemblaggio del complesso di inizio della traduzione eIF4F e l'attivazione della traduzione cap-dipendente. Tutte queste vie sono altamente coinvolte nella LMA, contribuendo agli adattamenti acquisiti aumentando la proliferazione cellulare, il metabolismo e la resistenza ai segnali apoptotici. (B) presenta le fasi principali del protocollo accoppiato di aspirazione del midollo osseo e colorazione intracellulare con fosfoflusso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68244/68244fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68244/68244fig02.jpg"> 
Figura 2: Visualizzazione delle fasi critiche durante la procedura di aspirazione del midollo osseo. L'area chirurgica e i materiali necessari sono allestiti sotto una cappa a flusso laminare. Dopo l'anestesia per inalazione di isoflurano (A), la superficie articolare femorale viene preparata per l'aspirazione (B,C). L'osso femorale viene perforato da una prima siringa allineata al centro dell'osso femorale (D). È fondamentale evitare di applicare una forte pressione all'ago ed eseguire invece un movimento di perforazione rotatorio; Questo di solito è sufficiente affinché l'ago penetri la superficie dell'osso e segua il percorso della cavità femorale. Successivamente, il midollo osseo viene aspirato con una seconda siringa attraverso il sito di puntura (I,J). Dopo aver trasferito l'aspirato di midollo osseo in una provetta da microcentrifuga (K), viene applicata una leggera pressione per fermare l'emorragia nell'area (L) e il topo viene posto in una gabbia calda e pulita per il recupero. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68244/68244fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68244/68244fig03.jpg"> 
Figura 3: Flusso di lavoro per l'analisi della strategia di gating, compresi i controlli isotipici. (A) rappresenta le strategie di gating per le cellule vive, l'esclusione dei doppietti e le cellule AML hCD45-positive. (B) mostra segnali per ogni fosfoproteina nel marrone e controlli isotipici nel nero (due repliche biologiche). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68244/68244fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68244/68244fig04.jpg"> 
Figura 4: Flusso di lavoro per la rilevazione e l'analisi delle fosfoproteine intracellulari dopo immuno-dichiarazione di cellule AML vitali del midollo osseo. (A) I topi NSG-SGM3 trapiantati con cellule AML donate dal paziente sono stati trattati con veicolo (controllo) o venetoclax, 5-azacitidina e cedazuridina (vene/aza/CDZ) o gilteritinib. Dopo 15 giorni, gli aspirati di midollo osseo (BM) sono stati processati. (B) rappresenta la strategia di gating per l'analisi di cellule AML vitali (ad es. hCD45/Zombie-NIR positive) 15 giorni dopo il trattamento. (C,D) rappresentano la normalizzazione del segnale per ciascuno dei fosfoanticorpi come indicato, in 10.000 cellule AML isolate da topi trattati con venetoclax/5-azacitidina/cedazuridina o veicolo (B) o gilteritinib o veicolo (C). Le tracce rappresentano i segnali nelle cellule AML isolate dal topo di controllo trattate con veicolo (azzurro), vene/aza/CDZ (rosso) o gilteritinib (viola). (E) L'istogramma rappresenta le variazioni del valore medio delle intensità di colorazione per ciascuna fosfoproteina testata su cellule umane vive di AML CD45+ da tre topi e SD. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard. Gli asterischi indicano differenze significative nelle intensità di colorazione valutate dall'ANOVA con valori p inferiori a 0,05 (*) e 0,01 (**). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68244/68244fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anticorpo</td>
			<td>Fluorocromo</td>
			<td>Diluizione</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-RPS6 (Ser240/244)</td>
			<td>AF594</td>
			<td>1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-4EBP1 (Thr37/46)</td>
			<td>AF488</td>
			<td>1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-STAT5 (Tyr694)</td>
			<td>PE</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-ERK1/2 (THR202/TYR204)</td>
			<td>AF647</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controllo delle IgG di coniglio</td>
			<td>AF594</td>
			<td>1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controllo delle IgG di coniglio</td>
			<td>AF488</td>
			<td>1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controllo delle IgG di coniglio</td>
			<td>PE</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controllo delle IgG di coniglio</td>
			<td>AF647</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1: Elenco delle diluizioni ottimizzate per gli anticorpi.
Figura supplementare 1: Confronto tra p-STAT5, p-RPS6, p-ERK1/2 e FSC-A in un campione rappresentativo di AML PDX. Questa figura mostra un esempio della relazione tra p-STAT5, p-ERK e p-RPS6 nel topo "E9" al giorno 15 di trattamento con venetoclax/5-azacitidina/cedazuridina (risultato dalla Figura 4C). In questo campione, la correlazione più forte nella colorazione delle fosfoproteine sembra essere tra p-STAT5 e p-RPS6 (A), che sono entrambi sovraregolati in questo gruppo sperimentale dopo il trattamento (Figura 4E). Sembra esserci una minore relazione tra p-STAT5 e p-ERK (B). È importante sottolineare che la dimensione delle cellule (valutata utilizzando FSC-A) non è un fattore importante per la positività complessiva di p-STAT5, evidenziando che la positività alla colorazione non è semplicemente un prodotto della dimensione delle cellule (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68244/Figure%20S1%20jove.pdf" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

Citometria intracellulare a fosfoflusso di pazienti con leucemia mieloide acuta Xenotrapianti derivati da pazienti

To adapt and resist approved treatments, acute myeloid leukemia (AML) cells activate specific molecular pathways that lead to changes in gene expression, ...

La nostra ricerca mira a capire come la leucemia mieloide acuta sviluppi resistenza alle terapie approvate. Basato sull'ipotesi che i metabolici giochino un ruolo chiave. L'obiettivo finale è identificare una strategia in grado di superare efficacemente questa resistenza. La citometria a flusso, ampiamente utilizzata nella ricerca sulla leucemia, è ideale per analizzare le cellule in sospensione come le cellule leucemiche. La sua adattabilità lo rende un potente strumento per i meccanismi molecolari dei dati. La principale sfida sperimentale nella ricerca sulla LMA è lo sviluppo di un protocollo ottimale in vivo per il reviving molecolare, che è la cellula per una modellazione accurata, comprendendo il meccanismo alla base della resistenza terapeutica.[Narratore] Per iniziare, piega il ginocchio del topo e usa la mano non dominante per immobilizzare la gamba in modo da esporre la superficie articolare del femore dove si trova il lato della puntura. Posiziona il pollice sulla tibia, l'indice sul femore e il medio sul lato esterno delle ossa per stabilizzarle. Mantenendo l'immobilizzazione, disinfettare l'area del ginocchio con alcol isopropilico per spostare i peli rimanenti e migliorare la visualizzazione della struttura ossea. Utilizzando la prima siringa asciutta calibro 25, posizionare l'ago al centro dell'articolazione del femore e ruotarlo delicatamente per creare un foro nella superficie articolare del femore senza applicare forza. Una volta che l'ago entra nel midollo, estrarre gradualmente la siringa ruotandola. Inserire la seconda siringa lavata nel foro creato dal primo ago. Applicare il vuoto sulla seconda siringa inserita nel femore ruotandola delicatamente e ritirandola gradualmente. Trasferire il midollo osseo estratto lavando il contenuto della siringa in una provetta da microcentrifuga refrigerata contenente 500 microlitri di PBS. Conservare il campione sul ghiaccio. Applicare una leggera pressione sul sito di puntura utilizzando un tampone di isopropanolo per 30 secondi per fermare qualsiasi sanguinamento. Centrifugare le celle a 500 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Utilizzando un sistema di aspirazione a vuoto, aspirare delicatamente ed eliminare il surnatante. Aggiungere 200 microlitri per campione di soluzione fluorescente per la colorazione cellulare. Diluito da uno a 100 in PBS per marcare le cellule morte. Risospendere delicatamente le cellule con una pipetta. Quindi incubare le cellule su ghiaccio per 10 minuti, al riparo dalla luce. Dopo 10 minuti, centrifugare le celle a 500G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Aspirare e scartare il surnatante utilizzando un sistema a vuoto, aggiungere 100 microlitri per campione di anticorpo HCD 45 Brilliant ultraviolet 395 diluito a 100 in PBS contenente il 2% di siero fetale bovino per marcare le cellule ematopoietiche umane. Incubare le cellule sul ghiaccio per 15 minuti, assicurandosi che siano protette dalla luce. Centrifugare le celle a 500 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Aspirare ed eliminare il surnatante utilizzando un sistema a vuoto. Risospendere il pellet in un millilitro di formaldeide all'1,6% in soluzione di PBS. Incubare a temperatura ambiente per 10 minuti, al riparo dalla luce. Dopo 10 minuti, centrifugare le celle a 500G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Aspirare ed eliminare il surnatante utilizzando un sistema a vuoto. Ora aggiungi un millilitro di metanolo al 100%, pre-raffreddato a meno 20 gradi Celsius direttamente nei due. Incubare i campioni a meno 20 gradi Celsius per 30 minuti al riparo dalla luce. Centrifugare le celle a 500 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Utilizzando un sistema a vuoto, aspirare e scartare il surnatante. Aggiungere 50 microlitri di soluzione miscelata di anticorpi o di soluzione miscelata per il controllo isotipografico a ciascun campione. Risospendere delicatamente le cellule con una pipetta, incubare tutti i campioni durante la notte a quattro gradi Celsius, assicurandosi che siano protetti dalla luce. Quindi, centrifugare le celle a 500 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver scartato il surnatante, lavare le cellule con 1000 microlitri di PBS risospendendole delicatamente con una pipetta. Centrifugare nuovamente le celle a 500 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver scartato il surnatante, eseguire un secondo lavaggio utilizzando 1000 microlitri di PBS e risospendere delicatamente le cellule con una pipetta prima di centrifugare nuovamente le cellule a quattro gradi Celsius. Dopo aver aspirato il surnatante, risospendere i campioni finali in 200 microlitri di PBS. Questa figura illustra il flusso di lavoro, la strategia di gating e la normalizzazione dei segnali intracellulari delle fosfoproteine nelle cellule del midollo osseo da topi xenotrapiantati derivati da pazienti con leucemia mieloide acuta trattati con terapia a base di venetoclax per 15 giorni. La strategia di gating ha identificato con successo la leucemia mieloide acuta umana vitale o le cellule AML in base ai profili di dispersione diretta e laterale e alla positività al CD45, consentendo un'analisi coerente in tutti i gruppi di trattamento. Il trattamento con Venetoclax 5-azacitidina e CDZ uridina ha portato ad un aumento della fosforilazione di STAT5 e RPS6 nelle cellule AML, suggerendo l'attivazione di vie di sopravvivenza associate alla resistenza. È interessante notare che, quando i topi sono stati trattati con Gilteritinib, il trattamento non ha ridotto significativamente la fosforilazione delle proteine della via FLT3, indicando che la segnalazione persisteva nonostante la terapia mirata. STAT5 fosforilato e RPS6 fosforilato hanno mostrato il più forte aumento della correlazione nei livelli di espressione dopo la terapia a base di venetoclax, indicando la coattivazione di queste vie.

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Questo video dimostra la valutazione della fosforilazione intracellulare delle proteine indotta da citochine stromali nelle cellule leucemiche. Queste proteine fosforilate intracellulari vengono quantificate utilizzando la tecnica della citometria a fosfoflusso.

Valutazione della fosforilazione delle proteine intracellulari indotta da citochine stromali mediante citometria a flusso fosfoidale

Descriviamo un protocollo per rilevare l'espressione simultanea di marcatori di cellule staminali leucemia sulle cellule di leucemia mieloide acuta primaria tramite flusso cytometry. Vi mostriamo come quantificare tre popolazioni di cellule progenitrici e una popolazione di LSC putativa con crescente grado di maturazione. Abbiamo confermato la presenza di queste popolazioni in corrispondente paziente-derivato-xenotrapianti.

Il flusso Cytometry per stimare cellule staminali leucemia nella leucemia mieloide acuta primaria e negli xenotrapianti paziente-derivato, alla diagnosi ed al Follow Up

La procedura sperimentale su immunophenotyping di omotrapianti PDAC murino ortotopico mira a profilatura immuno-microambiente tumorale. I tumori sono orthotopically impiantato tramite intervento chirurgico. Tumori di 200 – 600 mm3 dimensioni sono state raccolte e dissociati per preparare sospensioni unicellulari, seguite da analisi dell'indicatore multi-immuni FACS usando diversi anticorpi fluorescente etichettati.

Immunophenotyping di Orthotopic omotrapianto (Syngeneic) dell'Adenocarcinoma Ductal pancreatico murino primario KPC tramite flusso Cytometry

Descriviamo un metodo per l'utilizzo di citometria a flusso multiparametrico per rilevare le specie di ossigeno reattivo mitocondriale (ROS) in cellule staminali e progenitrici (HSPC) e cellule leucemiche da un modello murino di leucemia mieloide acuta (AML) MLL-AF9.

Flusso Analisi citometrica delle specie di ossigeno reattivo mitocondriale nelle cellule staminali e semigeniche Murine Hematopoietic e MLL-AF9 Driven Leucemia

Presentiamo due diversi protocolli di colorazione per il rilevamento del ligando NKG2D (NKG2DL) nei campioni di leucemia mieloide acuta primaria umana (AML). Il primo approccio si basa su una proteina di fusione, in grado di riconoscere tutti i ligandi noti e potenzialmente ancora sconosciuti, mentre il secondo protocollo si basa sull'aggiunta di anticorpi anti-NKG2DL multipli.

Due approcci citometrici a flusso del rilevamento della superficie del ligando NKG2D per distinguere le cellule staminali dalle sottopopolazioni di massa nella leucemia mieloide acuta

Qui, descriviamo un protocollo in cui un modello di xenotrapianto derivato dal paziente di leucemia linfoblastica acuta viene utilizzato come strategia per valutare e monitorare le tossicità associate alle cellule T del recettore dell'antigene chimerico mirato al CD19.

Valutazione delle tossicità associate alle cellule T del recettore dell'antigene chimerico utilizzando un modello murino di xenotrapianto derivato dal paziente per la leucemia linfoblastica acuta

Qui, l'iniezione intra-peritoneale delle cellule leucemiche viene utilizzata per stabilire e propagare la leucemia mieloide acuta (LMA) nei topi. Questo nuovo metodo è efficace nel trapianto seriale di cellule LMA e può servire come alternativa per coloro che possono sperimentare difficoltà e incongruenze con l'iniezione endovenosa nei topi.

Trapianto intra-peritoneale per la generazione di leucemia mieloide acuta nei topi

Questo protocollo fornisce istruzioni dettagliate per la generazione e la risoluzione dei problemi di xenotrapianti di leucemia linfoblastica acuta umana (ALL) da linee cellulari e materiale fresco del paziente in embrioni di zebrafish transitoriamente immunosoppressi, insieme a linee guida per la valutazione della risposta ai farmaci mediante citometria a flusso. La pipeline sperimentale può essere adattata anche per i tumori solidi.

Previsione rapida della risposta ai farmaci in vivo utilizzando innesti di cellule leucemiche in embrioni di zebrafish

Questo protocollo descrive in ovo xenotrapianto di cellule di leucemia linfoblastica acuta (ALL) B e T derivate da pazienti, che si verifica 4 giorni dopo l'iniezione.

Nell'Ovo Xenotrapianto di cellule di leucemia linfoblastica acuta (ALL) derivate da pazienti (PDX-ALL)

Questo video mostra la procedura per la differenziazione delle cellule dendritiche mieloidi dal midollo osseo dei topi. Isolamento di tibia e femore del mouse, e la lavorazione del midollo osseo sono dimostrati. Immagini che dimostrano morfologia cellulare prima e dopo la differenziazione, e le figure raffiguranti fenotipo delle cellule e IL-12 maturazione di produzione utilizzando i seguenti CpG sono mostrati.

Cultura di cellule dendritiche mieloidi dai precursori del midollo osseo

Impara la citometria intracellulare a fosfoflusso per analizzare le vie di segnalazione mTORC1, JAK/STAT5 e MAPK nelle cellule di leucemia mieloide acuta xenotrapiantate. Questo metodo offre informazioni preziose per lo sviluppo di terapie mirate contro il cancro.

Citometria intracellulare a fosfoflusso di pazienti con leucemia mieloide acuta Xenotrapianti derivati da pazienti

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