Citometria intracellulare a fosfoflusso di pazienti con leucemia mieloide acuta Xenotrapianti derivati da pazienti

La nostra ricerca mira a capire come la leucemia mieloide acuta sviluppi resistenza alle terapie approvate. Basato sull'ipotesi che i metabolici giochino un ruolo chiave. L'obiettivo finale è identificare una strategia in grado di superare efficacemente questa resistenza. La citometria a flusso, ampiamente utilizzata nella ricerca sulla leucemia, è ideale per analizzare le cellule in sospensione come le cellule leucemiche. La sua adattabilità lo rende un potente strumento per i meccanismi molecolari dei dati. La principale sfida sperimentale nella ricerca sulla LMA è lo sviluppo di un protocollo ottimale in vivo per il reviving molecolare, che è la cellula per una modellazione accurata, comprendendo il meccanismo alla base della resistenza terapeutica.

[Narratore] Per iniziare, piega il ginocchio del topo e usa la mano non dominante per immobilizzare la gamba in modo da esporre la superficie articolare del femore dove si trova il lato della puntura. Posiziona il pollice sulla tibia, l'indice sul femore e il medio sul lato esterno delle ossa per stabilizzarle. Mantenendo l'immobilizzazione, disinfettare l'area del ginocchio con alcol isopropilico per spostare i peli rimanenti e migliorare la visualizzazione della struttura ossea. Utilizzando la prima siringa asciutta calibro 25, posizionare l'ago al centro dell'articolazione del femore e ruotarlo delicatamente per creare un foro nella superficie articolare del femore senza applicare forza. Una volta che l'ago entra nel midollo, estrarre gradualmente la siringa ruotandola. Inserire la seconda siringa lavata nel foro creato dal primo ago. Applicare il vuoto sulla seconda siringa inserita nel femore ruotandola delicatamente e ritirandola gradualmente. Trasferire il midollo osseo estratto lavando il contenuto della siringa in una provetta da microcentrifuga refrigerata contenente 500 microlitri di PBS. Conservare il campione sul ghiaccio. Applicare una leggera pressione sul sito di puntura utilizzando un tampone di isopropanolo per 30 secondi per fermare qualsiasi sanguinamento. Centrifugare le celle a 500 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Utilizzando un sistema di aspirazione a vuoto, aspirare delicatamente ed eliminare il surnatante. Aggiungere 200 microlitri per campione di soluzione fluorescente per la colorazione cellulare. Diluito da uno a 100 in PBS per marcare le cellule morte. Risospendere delicatamente le cellule con una pipetta. Quindi incubare le cellule su ghiaccio per 10 minuti, al riparo dalla luce. Dopo 10 minuti, centrifugare le celle a 500G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Aspirare e scartare il surnatante utilizzando un sistema a vuoto, aggiungere 100 microlitri per campione di anticorpo HCD 45 Brilliant ultraviolet 395 diluito a 100 in PBS contenente il 2% di siero fetale bovino per marcare le cellule ematopoietiche umane. Incubare le cellule sul ghiaccio per 15 minuti, assicurandosi che siano protette dalla luce. Centrifugare le celle a 500 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Aspirare ed eliminare il surnatante utilizzando un sistema a vuoto. Risospendere il pellet in un millilitro di formaldeide all'1,6% in soluzione di PBS. Incubare a temperatura ambiente per 10 minuti, al riparo dalla luce. Dopo 10 minuti, centrifugare le celle a 500G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Aspirare ed eliminare il surnatante utilizzando un sistema a vuoto. Ora aggiungi un millilitro di metanolo al 100%, pre-raffreddato a meno 20 gradi Celsius direttamente nei due. Incubare i campioni a meno 20 gradi Celsius per 30 minuti al riparo dalla luce. Centrifugare le celle a 500 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Utilizzando un sistema a vuoto, aspirare e scartare il surnatante. Aggiungere 50 microlitri di soluzione miscelata di anticorpi o di soluzione miscelata per il controllo isotipografico a ciascun campione. Risospendere delicatamente le cellule con una pipetta, incubare tutti i campioni durante la notte a quattro gradi Celsius, assicurandosi che siano protetti dalla luce. Quindi, centrifugare le celle a 500 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver scartato il surnatante, lavare le cellule con 1000 microlitri di PBS risospendendole delicatamente con una pipetta. Centrifugare nuovamente le celle a 500 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver scartato il surnatante, eseguire un secondo lavaggio utilizzando 1000 microlitri di PBS e risospendere delicatamente le cellule con una pipetta prima di centrifugare nuovamente le cellule a quattro gradi Celsius. Dopo aver aspirato il surnatante, risospendere i campioni finali in 200 microlitri di PBS. Questa figura illustra il flusso di lavoro, la strategia di gating e la normalizzazione dei segnali intracellulari delle fosfoproteine nelle cellule del midollo osseo da topi xenotrapiantati derivati da pazienti con leucemia mieloide acuta trattati con terapia a base di venetoclax per 15 giorni. La strategia di gating ha identificato con successo la leucemia mieloide acuta umana vitale o le cellule AML in base ai profili di dispersione diretta e laterale e alla positività al CD45, consentendo un'analisi coerente in tutti i gruppi di trattamento. Il trattamento con Venetoclax 5-azacitidina e CDZ uridina ha portato ad un aumento della fosforilazione di STAT5 e RPS6 nelle cellule AML, suggerendo l'attivazione di vie di sopravvivenza associate alla resistenza. È interessante notare che, quando i topi sono stati trattati con Gilteritinib, il trattamento non ha ridotto significativamente la fosforilazione delle proteine della via FLT3, indicando che la segnalazione persisteva nonostante la terapia mirata. STAT5 fosforilato e RPS6 fosforilato hanno mostrato il più forte aumento della correlazione nei livelli di espressione dopo la terapia a base di venetoclax, indicando la coattivazione di queste vie.