Tecniche efficienti per il campionamento completo di tessuti accessibili in Xenopus adulto

Questo lavoro mira a creare un metodo replicabile per raccogliere rapidamente il ventricolo cardiaco di Xenopus, il tronco arterioso, il lobo del fegato sinistro, la cistifellea, il polmone, il pancreas, la milza, la laringe, l'esofago, lo stomaco, l'intestino, i testicoli, il corpo grasso, l'ovidotto, i reni accoppiati, il plesso sciatico, la pelle, il timo e l'intero occhio in meno di un'ora. Una sfida sperimentale è l'ottimizzazione della freschezza dei tessuti. Per questo motivo, il protocollo è stato progettato per essere completato in meno di un'ora. Dando priorità alla freschezza dei tessuti, questi tessuti possono essere utilizzati per completare analisi biochimiche di alta qualità come la proteomica, riducendo al minimo il numero di animali utilizzati. In futuro, scriveremo un protocollo sui tessuti a cui è più difficile accedere, come il cervello, i muscoli e le ossa.

[Istruttore] Per iniziare, posiziona la rana soppressa per la procedura di dissezione e fissa gli arti. Usando le forbici da dissezione, taglia la pelle lungo la linea mediana e poi lateralmente per creare due lembi di pelle. Usando una pinza, afferrare la linea alba ed estrarla dalla cavità celomica. Tagliare con cura la muscolatura verso la testa e creare due lembi della parete della cavità. Riduci le ossa coracoidi per ottenere un migliore accesso al cuore. Allunga il pericardio, perforalo e staccalo per esporre le tre camere cardiache. Ora taglia gli oracoli all'incrocio dove incontrano il ventricolo e il tronco arterioso. Usa una pinza per afferrare l'apice del ventricolo e tagliarlo appena sotto la sua giunzione con il tronco arterioso, lasciando un margine. Osservando la biforcazione del tronco arterioso, tirare il tronco teso e tagliare i tronchi aortici subito dopo i punti in cui si dividono in archi. Quindi, afferra il labbro del lobo del fegato sinistro e sollevalo delicatamente per esporre i dotti epatici e cistici. Campiona i due terzi inferiori del lobo sinistro sotto questi attacchi. Dopo aver identificato la cistifellea, afferrarla ed estrarla dal lobo destro del fegato e recidere il suo attacco. Quindi afferra l'apice del polmone e tiralo teso. Taglia il polmone al limite dove passa al bronco. Rimuovere il bronco dalla laringe. Per la rimozione delle ovaie, spostare i lobi ovarici ai rispettivi lati per visualizzare i siti di attacco ventrali ai reni. Usando le forbici, rimuovere le ovaie vicino ai reni senza causare danni. Successivamente, ispezionare il lobo anteriore del fegato, noto anche come lobo mediano, e osservare la sua connessione con il duodeno attraverso il mesenario. Usa le forbici per iridectomia per recidere il legamento mesenario e il legamento epatoduodenale. La restante massa carnosa è costituita dal pancreas e dal dotto biliare comune. Recidere la connessione del pancreas e del dotto biliare comune dal lobo epatico anteriore, lasciando un margine. Afferrare lo stomaco con una pinza dentata e un'estremità del pancreas con una pinza per tessuti. Sotto ingrandimento, stuzzicare delicatamente il pancreas lontano dallo stomaco. Quindi identificare la milza e campionarla tagliando il suo attacco al peritoneo. Afferra la laringe per la sua estremità inferiore e inizia a sollevarla dalla cavità, tagliando eventuali attacchi peritoneali man mano che vengono incontrati. Quando la laringe è sollevata, usa le forbici per iridectomia curve per separare e tagliare con cura il tessuto esofageo dalla laringe. Quindi tirare la laringe verso il basso e tagliarla dalla cavità orale recidendo gli accessori visibili rimanenti. Osservare la curvatura dello stomaco, che lo distingue dall'esofago e la restrizione pilorica che segna l'inizio dell'intestino. Tagliare il canale alimentare appena anteriormente alla curvatura dello stomaco per separarlo dall'esofago. Apri la bocca e individua l'apertura condivisa delle tube di Eustachio sul suo tetto. Tenendo la bocca aperta, tirare l'esofago per osservarne l'attaccamento. Quindi tagliare l'esofago dalla cavità buccale appena sotto l'apertura di Eustachio. Quindi rimuovere l'esofago. Ora afferra lo stomaco e taglialo in corrispondenza della restrizione pilorica dove si collega al duodeno. Tendere il colon e tagliarlo il più vicino possibile alla cloaca. Rimuovere l'intestino, tagliando eventuali attacchi peritoneali visibili lungo il percorso. Se la rana è maschio, identifica i testicoli e rimuovine uno usando le forbici per iridectomia, assicurandoti che il rene rimanga intatto. Separare i corpi adiposi e posizionarli sui rispettivi lati per esporre l'attacco peritoneale vicino al rene. Afferra la base di un corpo grasso e tagliala dal peritoneo, lasciando un margine. Per rimuovere la vescica urinaria, tagliare il più vicino possibile alla cloaca. Se la rana è femmina o ha un ovidotto vestigiale visibile, afferra l'estremità inferiore dell'ovidotto e tirala via dalla cloaca. Tagliare l'ovidotto vicino alla cloaca e poi estrarlo dalla cavità celomica, recidendo eventuali attacchi peritoneali. Usando una pinza, afferrare i reni accoppiati retroperitoneali e recidere il peritoneo alla loro base. Sollevare i reni dalla cavità, recidendo tutti gli attacchi peritoneali. Quindi, afferra il fascio nervoso al plesso sciatico con una pinza e taglia i nervi dove escono dalla cavità celomica. Sollevare il fascio nervoso e tagliarlo di nuovo in corrispondenza della sua connessione con la colonna vertebrale. Ora rimuovi gli spilli e capovolgi l'animale sul lato ventrale. Riappuntare gli arti e selezionare un arto posteriore per il campionamento, bloccando il piede. Asportare una sezione di pelle a forma di mandorla sopra il gastrocnemio e la regione tibio-fibulare. Afferra la pelle dorsale e fai un'incisione laterale attorno alla parte centrale dell'animale. Per creare un taglio circolare continuo. Rimuovere i perni, fissare le gambe con una mano e utilizzare una pinza dentata di ratto per afferrare la pelle dorsale anteriore. Scuoiare l'animale tirando con forza la pelle dorsale sopra la testa e le braccia. Per campionare il timo, identificare la massa grassa che copre l'articolazione della mascella e tagliare il bordo posteriore della massa dove si fonde con il tessuto muscolare rosa. Usa le forbici per iridectomia per tagliare via la massa dall'osso rivelando grappoli di melanofori, se presenti. Quindi taglia il tessuto per eliminare eventuali muscoli o cartilagine. Quindi, ripeti l'animale e seleziona un occhio. Inserisci le forbici per iridectomia curve nell'orbita e taglia delicatamente attorno alla curvatura dell'occhio per rilasciare gli attacchi muscolari. Infine, fai scorrere le forbici più in profondità nell'orbita e taglia il nervo ottico dietro l'occhio. Sganciare l'occhio dalla sua orbita e tagliare via il muscolo rimasto. Seguendo questa procedura, tutti gli organi principali sono stati estratti, sciacquati e tagliati entro un'ora dall'eutanasia.