Produzione riproducibile di SPOT come piattaforma di coltura basata su scaffold ad alta produttività

La nostra ricerca si concentra sullo sviluppo di piattaforme ad alto rendimento supportate da scaffold per colture orgonomiche robuste, riproducibili e derivate da pazienti, al fine di migliorare il flusso di lavoro dei saggi di screening dei farmaci e aiutare la modellazione avanzata delle malattie.

Manipolatori di liquidi automatizzati, piattaforme di idrogel supportate da scaffold, tecnologie organ-on-a-chip e saggi a singola cellula come la citometria a flusso e i CYTOP sono alcune delle tecnologie attualmente disponibili.

Le sfide attuali includono la conservazione dell'integrità dell'idrogel, il superamento del menisco in gel per l'imaging in tempo reale e la garanzia di una distribuzione uniforme delle cellule nei saggi a lungo termine basati su organoidi.

Il nostro protocollo consente un caricamento costante di idrogel supportato da scaffold, riduce al minimo i problemi del menisco, supporta la coltura di organoidi a lungo termine e si integra perfettamente con i gestori di liquidi automatizzati e il sistema di imaging ad alto contenuto.

Siamo molto entusiasti di utilizzare le nostre piattaforme di modellazione della malattia per esplorare i meccanismi di progressione della malattia nel cancro e lo sviluppo dell'obesità.

[Istruttore] Per iniziare, prendi un'impalcatura in PMMA per 96 o 384 SPOT. Taglia la carta in eccesso attorno alla regione blu dell'impalcatura, lasciando un margine bianco di cinque millimetri attorno al perimetro. Assicurati che il foglio risultante misuri circa 760 millimetri per 1.300 millimetri. Per preparare un ponteggio 96 SPOT per il montaggio, stendere un pezzo di pellicola di polietilene su un supporto acrilico rigido. Posizionare questo supporto ricoperto di pellicola sul piano di lavoro e posare l'impalcatura sopra la pellicola di polietilene. Allinea il bordo di un righello tra le prime due file dell'impalcatura per evitare di entrare nei pozzetti. Posizionare la rotella di tracciamento nella parte inferiore dell'impalcatura e farla rotolare verso l'alto fino in cima, guidata dal righello. Per uno scaffold 384 SPOT, non eseguire la perforazione. Quindi, posare l'impalcatura con il lato ruvido rivolto verso l'alto su una soletta PDMS, assicurandosi che le file scorrano orizzontalmente. Usa la linea di adescamento per determinare quale lato è ruvido, quindi leviga l'impalcatura sulla lastra per rimuovere rughe o bolle. Rimuovere lo strato protettivo dal lato non inciso del nastro biadesivo. Allacciare leggermente il nastro al centro e allineare le due colonne centrali del nastro con l'impalcatura. Ora, premi il centro del nastro sull'impalcatura per garantire l'allineamento. Lisciare il nastro verso l'esterno dal centro per fissarlo in modo uniforme. Usando una pinzetta, sollevare delicatamente l'impalcatura dalla lastra PDMS. Conservare la lastra per un uso futuro. Per fissare l'impalcatura al nastro del secondo pozzo, capovolgere l'impalcatura in modo che il lato liscio e non nastrato sia rivolto verso l'alto sul banco di lavoro. Rimuovere lo strato protettivo centrale dal lato inciso del secondo nastro per esporre le due colonne centrali. Allacciare leggermente il centro del secondo nastro e allinearlo alle colonne centrali dell'impalcatura, quindi premere il centro del nastro per fissarlo in posizione. Se si utilizza del nastro inciso, rimuovere gli strati protettivi rimanenti adiacenti al centro esposto. Lisciare il nastro, partendo dal centro e spostandolo verso l'esterno. Per fissare l'impalcatura alla piastra senza fondo, rimuovere lo strato protettivo. Allineare l'impalcatura sotto la piastra senza fondo con un coperchio. Una volta allineato, premere al centro sulla piastra. Se si utilizza del nastro inciso, rimuovere gli strati adiacenti e lisciare l'impalcatura sulla piastra verso l'esterno dal centro. Per fissare l'impalcatura alla pellicola in policarbonato, utilizzare una pinzetta per allentare con cura lo strato protettivo da un lato della pellicola in policarbonato, quindi staccare lentamente lo strato protettivo senza causare rientranze nella pellicola. Ripetere il processo per il secondo lato, quindi mettere da parte la pellicola sul banco di lavoro. Staccare lo strato di nastro protettivo dal fondo della piastra e premere la pellicola di policarbonato sull'impalcatura dal centro verso l'esterno. Quindi premere con decisione la pellicola di policarbonato sull'impalcatura per assicurarsi che ogni pozzetto abbia un bordo definito. Usando un coltello di precisione, tagliare con cura il materiale in eccesso dal fondo della piastra. Dopo il completo assemblaggio, posizionare la piastra 96 SPOT in un sacchetto di plastica trasparente e richiudibile e portarla fuori dall'armadio di biosicurezza. Posizionare un supporto acrilico rigido sotto la piastra e bloccare entrambi agli angoli opposti. Conservare la piastra in un luogo pulito e asciutto fino a nuovo utilizzo. Non sono state osservate perdite o scambi di fluidi quando i pozzetti alternati nella piastra 384 SPOT sono stati riempiti con fluoresceina e PBS durante un periodo di test di 30 giorni, confermando l'efficacia della barriera PMMA nel mantenere l'isolamento da pozzetto a pozzetto. Gli organoidi tumorali pancreatici che esprimono GFP seminati in 96 piastre SPOT sono rimasti vitali e si sono espansi progressivamente dal giorno zero al giorno 12 di coltura. Il giorno 12, gli organoidi cresciuti in SPOT hanno mostrato una forte espressione di citocheratina 19 e Zonula Occludens-1, insieme alla presenza di strutture interne del lume. I risultati di semina tissutale subottimali e ottimali in 384 piastre SPOT erano visivamente distinguibili per definizione dei bordi e uniformità della distribuzione cellulare. La semina uniforme è stata ottenuta in modo uniforme su tutte le 96 piastre SPOT e 384 SPOT utilizzando il manipolatore automatico di liquidi.