Saggio della cometa per quantificare il danno al DNA nelle cellule 32D che esprimono mutanti FLT3 dopo l'esposizione a inibitori FLT3 di tipo I e II

Utilizziamo il test comet per valutare sistematicamente la genotossicità degli inibitori FLT3 di tipo I e II su cellule mutanti 32D FLT3, fornendo dati critici per l'ottimizzazione clinica nella LMA. Durante le procedure, una manipolazione impropria dello strumento di microchirurgia altererà il vetrino, con conseguente perdita di campione. La ricerca indica che AC220 come inibitore di tipo II infligge danni più gravi al DNA sulle cellule mutanti FLT3, fornendo informazioni cruciali per lo sviluppo di terapie combinate sfruttando la vulnerabilità al danno al DNA per superare la resistenza terapeutica.

Studiare il meccanismo d'azione degli inibitori di FLT3 nel trattamento della LMA e sviluppare strategie di terapia combinata a doppio o più farmaci basate sugli inibitori di FLT3. Per iniziare, preparare una miscela 10 a uno di agarosio a basso punto di fusione e sospensione cellulare in provette da 1,5 millilitri utilizzando una pipetta e mescolare delicatamente. Erogare 55 microlitri di aliquote della miscela di cellule di agarosio sui vetrini della cometa utilizzando una pipetta tenuta a un angolo di 45 gradi.

Quindi, posizionare i vetrini rivestiti con la miscela a quattro gradi Celsius per 30 minuti in un ambiente buio. Immergere i vetrini solidificati in una soluzione di lisi pre-raffreddata e incubare per almeno un'ora a quattro gradi Celsius, proteggendo i vetrini dalla luce. Dopo la lisi, rimuovere i vetrini dalla soluzione di lisi.

Utilizzando una pistola per pipette, aspirare con cura quanto più liquido residuo possibile intorno alla paletta. Quindi, posizionare i vetrini in un tampone di elettroforesi alcalina e lasciarli pre-equilibrare per un'ora a quattro gradi Celsius al buio. Ora, posiziona i vetrini nella camera di elettroforesi.

Per immergere completamente i vetrini, aggiungere una quantità sufficiente di soluzione di elettroforesi alcalina pre-raffreddata. Eseguire l'elettroforesi a 24 volt con una corrente costante per 30 minuti utilizzando un tampone pre-bilanciato per ridurre i danni al DNA. Dopo l'elettroforesi, utilizzare una pistola per pipette per aspirare il tampone per elettroforesi alcalina intorno al vetrino.

Immergere i vetrini in acqua distillata doppia per cinque minuti, quindi immergere i vetrini in etanolo al 70% per cinque minuti. Posizionare i vetrini in un'incubatrice impostata a 37 gradi Celsius per 15 minuti ad asciugare. Quindi, applicare un'aliquota da 100 microlitri di colorante di acido nucleico YeaRed su ciascun pozzetto del vetrino.

Incubare i vetrini per 30 minuti a 28 gradi Celsius in un ambiente protetto dalla luce. Sciacquare delicatamente i vetrini con acqua per rimuovere la macchia in eccesso e asciugarli in un'incubatrice a 37 gradi Celsius. Il test della cometa è stato sistematicamente impiegato per quantificare i profili differenziali di danno al DNA indotti da Gilteritinib e AC220 in linee cellulari mutanti FLT3.

L'analisi quantitativa della percentuale di DNA della coda ha confermato che entrambi i composti aumentano significativamente il danno al DNA dopo due, quattro e sei ore, con AC220 che produce livelli di danno più elevati rispetto a Gilteritinib in ogni momento. Tutte le misurazioni della coda del momento hanno rispecchiato l'andamento del DNA della coda con aumenti statisticamente significativi per entrambi i trattamenti da due a sei ore e valori OTM più elevati osservati nel gruppo AC220 per tutto il tempo.