Un framework di imaging multimodale per far progredire la fenotipizzazione di cellule viventi di cancro al seno senza etichetta

Ora il nostro protocollo, presentiamo l'imaging multimodale utilizzando la microspettroscopia Raman confocale e la microscopia di fase tomografica per una fenotipizzazione morfochimica rapida e imparziale delle cellule di cancro al seno umano nel loro ambiente fisiologico nativo. La combinazione della microspettroscopia Raman e della microscopia di fase tomografica consente l'imaging label-free in condizioni fisiologiche, fornendo informazioni biochimiche e morfologiche sulle cellule e affrontando i limiti dei metodi perturbativi convenzionali, come la marcatura a fluorescenza o la fissazione chimica. I nostri risultati dimostrano un alto potenziale nell'implementazione di un approccio multimodale nel fornire fenotipizzazione morfochimica delle cellule di cancro al seno. Inoltre, la sua versatilità, riproducibilità e non invasività lo hanno reso uno strumento promettente per un'ampia gamma di applicazioni biomediche, dagli studi fondamentali di biologia cellulare alla diagnostica.

Il nostro obiettivo è quello di creare un atlante di biomarcatori ottici per il controllo di qualità embrionale non invasivo, la rilevazione della senescenza cellulare e lo screening di farmaci in modelli di organoidi per far progredire la medicina rigenerativa e la ricerca sulle malattie.

[Istruttore] Per iniziare, posizionare il campione di cellule di cancro al seno umano MDA-MB-231 nell'incubatore sul palco. Aggiungere acqua per l'obiettivo di immersione in acqua. Accendere l'alimentatore automatico ad immersione in acqua per fornire acqua alla lente dell'obiettivo. Controllare regolarmente i livelli dell'acqua per evitare l'evaporazione e garantire condizioni di imaging coerenti durante le misurazioni. A questo punto, accendere il laser della pompa e regolarne l'uscita per ottenere una potenza laser di 75 milliwatt sul piano di campionamento. Aprire il software di controllo del microscopio Micro-Manager. Nelle impostazioni di configurazione, selezionare BF e fare clic su live sul lato sinistro della finestra del software. Scegliere la singola cella desiderata, quindi fare clic su stop per terminare la visualizzazione del campo chiaro. Aprire il software di controllo della telecamera CCD. Nell'impostazione dell'esperimento, imposta il tempo di esposizione su 1,5 secondi. Fare clic su Esegui sulla barra degli strumenti dell'esperimento e attivare il raggio laser. Quindi, regola la posizione Z per massimizzare il conteggio del segnale nella regione dell'impronta digitale da 600 a 1.800 centimetri inversi, quindi spegni il laser. Fare clic su Interrompi sulla barra degli strumenti dell'esperimento ed uscire dal software. Avvia il processo di acquisizione dei dati utilizzando lo script MATLAB, che gestisce automaticamente i canali Raman nelle misure multidimensionali e salva i dati. Impostate il campo visivo su un quadrato di 50 x 50 micrometri con una risoluzione di 40 x 40 pixel, ogni pixel copre un quadrato di 1,25 x 1,25 micrometri. Imposta il tempo di esposizione per ogni spettro Raman su 1,5 secondi ed esegui lo script MATLAB. Per la post-elaborazione delle mappe iperspettrali Raman, avviare lo strumento basato sul Web RamApp. Importa i dati iperspettrali cliccando su nuovo nella scheda le mie analisi e carica il file .mat contenente le variabili dei dati spaziali e spettrali, insieme alla variabile dell'asse X. Per troncare lo spettro, nel menu Ritaglia e ruota scegliere Ritaglio spettrale. Definisci i bordi inferiore e superiore della regione di spostamento Raman rispettivamente come 600 e 1.800 centimetri inversi. Per correggere i raggi cosmici, vai su denoising, fai clic su despike, seleziona Z-score come metodo e imposta la soglia su otto. Controlla le opzioni usa prima differenza e correggi picchi, quindi fai clic su Esegui per applicare la correzione. Per rimuovere il rumore dalle mappe, fai clic su Mappa uniforme, scegli il filtro mediano, imposta la dimensione del quadrato su tre pixel, quindi fai clic su Esegui. Per attenuare lo spettro di ciascun pixel, scegli il filtro Savistky-Golay. Impostare la lunghezza della finestra del filtro su sette e l'ordine polinomiale su due, quindi fare clic su Esegui. Per sottrarre il segnale di fondo medio, aprire la rimozione del substrato ottico e fare clic su Identifica substrato. Imposta k-means come metodo con due cluster. Quindi fare clic su Opzioni avanzate. Scegli la pulizia morfologica per rimuovere le piccole macchie dal primo piano, quindi fai clic su Esegui. Per rimuovere il segnale di fondo medio, fare clic su rimuovi substrato, quindi scegliere la media globale o la media del metodo centrale del 95% dei valori e fare clic su Esegui. Per correggere la fluorescenza di base, aprire il pannello di base, fare clic sulla linea di base corretta, selezionare la levigatezza adattiva PLS, quindi impostare lambda su 5 milioni e fare clic su Esegui. Per la normalizzazione di ogni mappa iperspettrale Raman, andare su Varie, selezionare Normalizza, scegliere il metodo Frobenius e fare clic su Esegui. Per generare un'immagine a falsi colori che mostra la distribuzione subcellulare, nel pannello delle immagini, fare clic sul simbolo del menu aperto sotto l'intensità dell'immagine, quindi fare clic su modifica immagine. Nel pannello di modifica, selezionare la banda singola e definire l'intervallo spettrale. Ora, scegli il doppio colore sulla mappa dei colori, quindi definisci il colore, la soglia di intensità e l'opacità prima di fare clic su conferma. Per il download di un singolo spettro di punti, scegli un pixel di interesse, quindi nel pannello della legenda spettrale, fai clic su Scarica spettro. Infine, per esportare gli spettri di primo piano e di substrato, accedere a legenda spettrale, quindi fare clic su scarica spettro per le sezioni di primo piano e di substrato. Posizionare una goccia di acqua distillata sulla lente dell'obiettivo del microscopio. Posizionare il campione sul tavolino di traslazione del microscopio, quindi regolare la posizione del campione per allinearlo con la lente dell'obiettivo. Accendi il microscopio e avvia il software di imaging. Fare clic sull'icona del microscopio sulla barra degli strumenti. Dopo l'inizializzazione, fare clic su configurazione, selezionare la cella attiva nel pannello di lavoro e PBS come supporto. Quindi, accedi alla scheda di calibrazione nel pannello di controllo del software di imaging. Impostare le posizioni assiali dell'obiettivo e delle lenti del condensatore selezionando rispettivamente la messa a fuoco e la superficie. Ora, fai clic sulla modalità di scansione per regolare manualmente le lenti e assicurarti che i modelli di illuminazione siano centrati e quasi statici. Scegli la modalità normale, quindi regola la fase di traslazione per portare la cella nel campo visivo e concentrarti sul campione. Regolare la fase di traslazione per individuare una regione senza celle. Scegliere Calibra per acquisire più ologrammi 2D a diversi angoli di illuminazione. Regola la fase di traslazione per centrare la cella, quindi vai alla scheda di acquisizione e seleziona l'istantanea 3D per acquisire il tomogramma della cella. Per visualizzare i tomogrammi olografici, selezionare i dati nel pannello di navigazione dati, fare clic con il pulsante destro del mouse e scegliere Apri. Nel pannello di gestione dati, fare clic su Tomogramma RI. Nel pannello di visualizzazione del volume, selezionare RI e disegnare quattro caselle di colore rettangolari all'interno dell'area di disegno RI. Imposta i valori minimo e massimo dell'intervallo RI per ogni casella di colore, quindi associa un'opacità e un colore a ciascuna casella. Fare clic su Salva per memorizzare gli intervalli di istanze riservate e le caselle di colore definiti. Per ottenere descrittori quantitativi della morfologia cellulare, utilizzare l'interfaccia di analisi. Selezionare manuale nel pannello di segmentazione, quindi impostare 1,3450 come soglia RI e fare clic su Applica. Fare clic su Salva per salvare gli indici morfologici calcolati. La mappatura spettrale Raman ha rivelato la distribuzione spaziale del citoplasma, del nucleo, della fenilalanina e dei lipidi all'interno delle singole cellule MDA-MB-231. Picchi spettrali Raman distinti corrispondenti al citoplasma, al nucleo, alla fenilalanina e ai lipidi sono stati confermati nella regione dell'impronta digitale tra 600 e 1.800 centimetri inversi. Le mappe di calore dell'indice di rifrazione delle singole cellule hanno rivelato la distribuzione interna dei componenti subcellulari nel piano XY assiale, nel piano YZ sagittale e nei piani XZ coronali. Una ricostruzione tomografica 3D ha identificato le regioni dell'indice di rifrazione volumetrico corrispondenti alle sottostrutture interne. Le misure morfologiche quantitative di una singola cellula MDA-MB-231 hanno mostrato diversi descrittori della morfologia cellulare, con un volume totale di 4024.189 micrometri cubi e una superficie di 2383.707 micrometri quadrati, con un indice di rifrazione medio di 1.356.