Name: In vivo Biotinilazione di prossimità per studi di interazione proteica in Paramecium tetraurelia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: Scopri la biotinilazione di prossimità in vivo per studiare le interazioni proteiche in Paramecium tetraurelia. Questo metodo con turboID consente l'arricchimento selettivo delle proteine biotinilate.

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<ol><li>Stefanov, B. -A., Nowacki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+and+mechanisms+of+eukaryotic+RNA-guided+programmed+DNA+elimination%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Functions and mechanisms of eukaryotic RNA-guided programmed DNA elimination.</a> Biochem Soc Trans. 53 (2), 473-485 (2025).</li>
<li>Swart, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+genetic+and+epigenetic+control+of+programmed+DNA+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of genetic and epigenetic control of programmed DNA deletion.</a> Nucleic Acids Res. 42 (14), 8970-8983 (2014).</li>
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<li>Dubois, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon+invasion+of+the+paramecium+germline+genome+countered+by+a+domesticated+piggybac+transposase+and+the+NHEJ+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Evol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transposon invasion of the paramecium germline genome countered by a domesticated piggybac transposase and the NHEJ pathway.</a> Int J Evol Biol. 2012, 436196(2012).</li>
<li>Gruchota, J., Denby Wilkes, C., Arnaiz, O., Sperling, L., Nowak, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+meiosis-specific+Spt5+homolog+involved+in+non-coding+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A meiosis-specific Spt5 homolog involved in non-coding transcription.</a> Nucleic Acids Res. 45 (8), 4722-4732 (2017).</li>
<li>Sandoval, P. Y., Swart, E. C., Arambasic, M., Nowacki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+diversification+of+Dicer-like+proteins+and+small+RNAs+required+for+genome+sculpting%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional diversification of Dicer-like proteins and small RNAs required for genome sculpting.</a> Dev Cell. 28 (2), 174-188 (2014).</li>
<li>Furrer, D. I., Swart, E. C., Kraft, M. F., Sandoval, P. Y., Nowacki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+sets+of+piwi+proteins+are+involved+in+distinct+sRNA+pathways+leading+to+elimination+of+germline-specific+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Two sets of piwi proteins are involved in distinct sRNA pathways leading to elimination of germline-specific DNA.</a> Cell Rep. 20 (2), 505-520 (2017).</li>
<li>Lepère, G., Bétermier, M., Meyer, E., Duharcourt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+noncoding+transcripts+antagonize+the+targeting+of+DNA+elimination+by+scanRNAs+in+Paramecium+tetraurelia%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Maternal noncoding transcripts antagonize the targeting of DNA elimination by scanRNAs in Paramecium tetraurelia.</a> Genes Dev. 22 (11), 1501-1512 (2008).</li>
<li>Garnier, O., Serrano, V., Duharcourt, S., Meyer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-mediated+programming+of+developmental+genome+rearrangements+in+Paramecium+tetraurelia%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">RNA-mediated programming of developmental genome rearrangements in Paramecium tetraurelia.</a> Mol Cell Biol. 24 (17), 7370-7379 (2004).</li>
<li>Khanduja, J. S., Calvo, I. A., Joh, R. I., Hill, I. T., Motamedi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+noncoding+RNAs+and+genome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear noncoding RNAs and genome stability.</a> Mol Cell. 63 (1), 7-20 (2016).</li>
<li>Yao, M. -C., Chao, J. -L., Cheng, C. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+genome+rearrangements+in+Tetrahymena%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectr%22%5BJournal%5D)">Programmed genome rearrangements in Tetrahymena.</a> Microbiol Spectr. 2 (6), (2014).</li>
<li>Nowacki, M., Zagorski-Ostoja, W., Meyer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nowa1p+and+Nowa2p%3A+Novel+putative+RNA+binding+proteins+involved+in+trans-nuclear+crosstalk+in+Paramecium+tetraurelia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Nowa1p and Nowa2p: Novel putative RNA binding proteins involved in trans-nuclear crosstalk in Paramecium tetraurelia.</a> Curr Biol. 15 (18), 1616-1628 (2005).</li>
<li>Drews, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+piwis+with+Ago-like+functions+silence+somatic+genes+at+the+chromatin+level%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Two piwis with Ago-like functions silence somatic genes at the chromatin level.</a> RNA Biol. 18 (sup2), 757-769 (2021).</li>
<li>Singh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ISWI1+complex+proteins+facilitate+developmental+genome+editing+in+Paramecium%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">ISWI1 complex proteins facilitate developmental genome editing in Paramecium.</a> Genome Res. 35 (1), 93-108 (2025).</li>
<li>Bernier, S. C., Cantin, L., Salesse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+the+expression%2C+solubility%2C+and+purification+of+a+passenger+protein+in+fusion+with+different+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of the expression, solubility, and purification of a passenger protein in fusion with different tags.</a> Protein Expr Purif. 152, 92-106 (2018).</li>
<li>Branon, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+proximity+labeling+in+living+cells+and+organisms+with+TurboID%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID.</a> Nat Biotechnol. 36 (9), 880-887 (2018).</li>
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<li>Stefanov, B. -A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+protein+thermometer+enables+precise+electrothermal+control+of+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci+%28Weinh%29%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded protein thermometer enables precise electrothermal control of transgene expression.</a> Adv Sci (Weinh). 8 (21), e2101813(2021).</li>
<li>Shin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+proximity+labeling+with+enhanced+direct+identification+of+biotinylation+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Super-resolution proximity labeling with enhanced direct identification of biotinylation sites.</a> Commun Biol. 7 (1), 554(2024).</li>
<li>Leffers, K. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+natural+and+recombinant+prion+protein+into+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Assembly of natural and recombinant prion protein into fibrils.</a> Biol Chem. 386 (6), 569-580 (2005).</li>
<li>Stefanov, B. -A., Ajuh, E., Allen, S., Nowacki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+release+factor+1+from+Euplotes+promotes+frameshifting+at+premature+stop+codons+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic release factor 1 from Euplotes promotes frameshifting at premature stop codons in human cells.</a> iScience. 27 (4), 109413(2024).</li>
<li>Stefanov, B. -A., Fussenegger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomarker-driven+feedback+control+of+synthetic+biology+systems+for+next-generation+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Biomarker-driven feedback control of synthetic biology systems for next-generation personalized medicine.</a> Front Bioeng Biotechnol. 10, 986210(2022).</li>
<li>Stefanov, B. -A., Mansouri, M., Charpin-El Hamri, G. -, Fussenegger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sunlight-Controllable+Biopharmaceutical+Production+for+Remote+Emergency+Supply+of+Directly+Injectable+Therapeutic+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Sunlight-Controllable Biopharmaceutical Production for Remote Emergency Supply of Directly Injectable Therapeutic Proteins.</a> Small. 18 (41), e2202566(2022).</li>
<li>Rzeszutek, I., Maurer-Alcalá, X. X., Nowacki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+genome+rearrangements+in+ciliates%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Programmed genome rearrangements in ciliates.</a> Cell Mol Life Sci. 77 (22), 4615-4629 (2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Microscopio Axiovert 40 CFL (lenti 10x, 40x)</td><td>Zeiss</td><td>Na</td><td></td></tr><tr><td>B-sitosterolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>567152</td><td></td></tr><tr><td>albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Codice: A9647</td><td></td></tr><tr><td>Olio CellTram</td><td>Ependorf</td><td>Na</td><td></td></tr><tr><td>Sequenza di DNA 3xHA-turboID ottimizzata per il codone</td><td>Twist bioscience</td><td>Na</td><td>GCTAGCTATCCATAcGAaGTTC CTGATTATGCTTATCCTTACGAT GTTCCTGATTATGCTTATCCTTAT GATGTACCTGATTACGCTGGATC AAAAGATAATACTGTACCTCTTAA ATTAATCGCTTTATTAGCTAATGG TGAATTTCATTCTGGTGAACAACbr/ AAAAGATAATACTGTTTAGCTAATGGbr/ TGAATTTCATTCTGGTGAACAAC... TTGGTGAAACTTTAGGTATGTCA AGAGCTGCTATTAATAAACACATT CAAACTTTAAGAGATTGGGGT TGATGTTTTTACTGTCCCTGGTAA AGGATATTCACTTCCTGAACCCAT TCCTTTATTAAATGCTAAACAAAT TTTAGGTCAATTAGATGGAGGTT CTGTTGCTGTTTTACCTGTTGTT GACTCAACTAATCAATATTTATTAG ATAGAATTGGTGAATTAAAGTCAG GTGATGCTTGTATTGCTGAATACC AACAAGCTGGTAGAGGTTCAAGA GGTAGAAAATGGTTTTCTCCTTTTTT tt GGTGCTAATTTATACCTTTCCATGT TCTGGAGACTTAAAAGAGGTCCCG CAGCTATTGGATTAGGTCCTGTCAT TGGTATTGTTATGGCTGAAGCTCT TAGAAAATTAGGTGCTGATAAGGT TAGAGTTAAATGGCCCCTAATGATTTA TATCTTCAAGATAGAAAACTTGCT GGTATACTTGTTGAATTAGCTGGT ATTACTGGTGATGCCGCTCAAATT GTTATCGGTGTGTTATTAATGTTG CTATGAGAAGAGTTGAAGAATCAG TTGTTAATCAAGGTTGGATTACTCT < TCAAGAAGCTGCTGTATAAATCTTGATbr/> AGAAACACTTTAGCTGCTACTCTCA TTAGAGAACTAGCTGCTTTAGA ATTATTTGAACAAGAAGGTTTGGCT CCTTATCTTCCTAGATGGGAAAAAT TAGATAATTTCATTAATAGACCTGTTA AATTAATTGGTGATAAAGAAATTT TCGGTATTTCAAGAGGTATAGATAAAC AAGGAGCTCTTTTATTAGAACAAGATG GTGTTATCAAACCATGGATGGGTGGT GAAATTTCATTGAGATCAGCTGAAAAA GAAATGA</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fischer Scientific</td><td>AAA151610B</td><td></td></tr><tr><td>Punte per microloader epT.I.P.S.</td><td>Ependorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Grogg Chemie</td><td>1009832500</td><td></td></tr><tr><td>FemtoJet 4i</td><td>Ependorf</td><td>Na</td><td></td></tr><tr><td>Femtopunta II</td><td>Calibro Scientifico</td><td>5242957000</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di formaldeide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>AppliChem</td><td>10021259</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo IgG anti-coniglio di capra, Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>A-11011</td><td></td></tr><tr><td>HA-tag (C29F4) mAB per conigli</td><td>sistemi cellulari</td><td>3724</td><td></td></tr><tr><td>InjectMan NI 2</td><td>Ependorf</td><td>Na</td><td></td></tr><tr><td>medio leggero</td><td>Na</td><td>Na</td><td>0,2x soluzione di polvere di erba di grano in 2,5 mM di Na2HPO4</td></tr><tr><td>Olio minerale</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Codice: M8691</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>Fenolo-Cloroformio-Isoamilalkohol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>77617</td><td></td></tr><tr><td>soluzione salina tamponata con fosforo&nbsp;</td><td>Fischer Scientific</td><td>10722497</td><td></td></tr><tr><td>Kit plasmide più midiprep</td><td>Qiagene</td><td>12945</td><td></td></tr><tr><td>Ricco di terreno</td><td>Na</td><td>Na</td><td>1x soluzione di polvere di erba di grano in 2,5 mM di Na2HPO4</td></tr><tr><td>Streptavidina-FITC</td><td>Thermo Fisher Scientifico</td><td>11-4317-87</td><td></td></tr><tr><td>Filtro centrifugo Ultrafree-MC GV</td><td>EMD Milipore</td><td>UFC30GV00</td><td></td></tr><tr><td>soluzione di lavaggio</td><td>Na</td><td>Na</td><td>0,1% BSA in acqua volvica&nbsp;</td></tr><tr><td>soluzione di polvere di erba di grano</td><td>Pini internazionali</td><td>Na</td><td>Preparare in 20 volte il brodo dalla polvere come descritto in precedenza (0,5 g/10 ml)</td></tr><tr><td>Streptavidina-HRP</td><td>abcam</td><td>AB7403</td><td></td></tr><tr><td>Perle magnatiche rivestite di streptavidina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>LSKMAGT02</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di lisi per pulldown</td><td>Na</td><td>Na</td><td>50 mM Tris pH 8; 150 mM di NaCl; 0,5% Sodio desossicolato; 1% Triton X-100; 5 mM di MgCl2; 2x inibitore della proteasi cOmplete (Roche); &nbsp;</td></tr><tr><td>Tampone di lavaggio 1 per pulldown</td><td>Na</td><td>Na</td><td>50 mM Tris pH 8; 150 mM di NaCl; 0,5% Sodio desossicolato; 1% Triton X-100; 5 mM di MgCl2;</td></tr><tr><td>Tampone di lavaggio 2 per pulldown</td><td>Na</td><td>Na</td><td>10 mM Tris pH 7,4; 150 mM di NaCl; 0,01 % NP40; 1 mM di MgCl2</td></tr><tr><td>Tampone di lavaggio 3 per pulldown</td><td>Na</td><td>Na</td><td>10 mM Tris pH 7,4; 150 mM di NaCl;</td></tr></tbody></table>

in vivo biotinilazione di prossimità per studi di interazione proteica in paramecium tetraurelia

In Vivo Proximity Biotinylation for Protein Interaction Studies in Paramecium tetraurelia

Il nostro protocollo descrive un metodo semplificato per l'introduzione di una modifica covalente della biotina nelle proteine in prossimità di una proteina bersaglio in Paramecium (Figura 1A). Queste proteine biotinilate possono quindi essere ulteriormente arricchite utilizzando un pulldown della streptavidina e identificate mediante spettrometria di massa20. Per dimostrare un caso d'uso pratico del metodo, abbiamo applicato il protocollo alla proteina Nowa1. Questa proteina è essenziale per il processo di riarrangiamento genomico e presenta alterazioni dinamiche nella sua localizzazione12. Nelle fasi iniziali, rimane nel vecchio nucleo somatico e nei frammenti, ma in seguito si trova nel nuovo nucleo in via di sviluppo. In particolare, i nostri precedenti tentativi di arricchimento mediato da tag delle proteine interagenti Nowa1 non hanno avuto successo (risultati non pubblicati). Ciò era probabilmente dovuto alle complesse ripetizioni somiglianti alla proteina prionica PrP27 che potevano causare l'autoaggregazione in condizioni non ottimali durante la procedura di pulldown21. La PCR ha amplificato la regione codificante Nowa1 insieme alla sua regione non codificante a monte contenente il promotore. Il prodotto è stato quindi inserito in un frame con una sequenza di codifica turboID ottimizzata per il codone (Figura 1B). Per evitare il silenziamento indotto dal transgene causato dall'iniezione di DNA circolare in Paramecium, il vettore è stato linearizzato prima dell'iniezione. Il DNA linearizzato e purificato è stato quindi microiniettato nel nucleo somatico (MAC) come descritto in questo protocollo. Una gocciolina dispersa confinata all'interno della regione più scura del nucleo somatico è diventata visibile in alcune delle iniezioni riuscite (Figura 1C). Il successo dell'iniezione e l'amplificazione del DNA da parte delle cellule durante la divisione cellulare sono stati quindi verificati mediante PCR. Come previsto, il 40-50% delle cellule era positivo per il DNA iniettato del costrutto Nowa1 (dimensione prevista del prodotto 685 bp) (Figura 2). Il passo successivo è stato quello di verificare la presenza della proteina codificata dal DNA iniettato. Poiché il vettore ricevente contiene la sequenza turboID affiancata da un triplo tag HA, abbiamo utilizzato la colorazione in immunofluorescenza per rilevare il tag. Questo ci ha permesso di verificare se le cellule iniettate esprimono la proteina di fusione e se è stata localizzata correttamente. Abbiamo utilizzato cellule in stadio avanzato che mostravano la localizzazione della proteina di fusione nei due nuovi nuclei in via di sviluppo, come precedentemente osservato per la proteina Nowa1 wild-type12. Le singole linee cellulari iniettate hanno mostrato livelli diversi della proteina di fusione (Figura 3). Un livello di espressione più basso può essere utile per le applicazioni in cui è desiderabile uno sfondo ridotto, ma in questo caso abbiamo optato per il segnale massimo e abbiamo proceduto con il clone 2, che ha mostrato l'espressione più alta. Abbiamo quindi raccolto campioni durante le diverse fasi di sviluppo per tracciare la localizzazione della proteina di fusione. La proteina è stata inizialmente localizzata nelle matasse formate dal vecchio nucleo somatico e nei frammenti nucleari separati durante le prime fasi dell'autogamia. Dopo la comparsa dell'anlageno nucleare, la proteina di fusione è passata verso questi nuovi nuclei in via di sviluppo (Figura 4). Per favorire la biotinilazione del proteoma prossimale nelle diverse fasi, abbiamo integrato la coltura con 500 μM di biotina per 2 ore prima di raccogliere le cellule per IF. Abbiamo visualizzato le proteine marcate con biotina tramite una colorazione IF utilizzando una streptavidina marcata in fluorescenza. Il segnale osservato corrispondeva alla localizzazione della proteina di fusione marcata con HA. È importante sottolineare che è stato possibile ottenere una localizzazione della biotinilazione specifica per le diverse fasi di sviluppo nucleare, poiché anche una breve incubazione con biotina è sufficiente per ottenere una biotinilazione significativa (Figura 4). Inoltre, senza l'aggiunta di biotina supplementare, nelle cellule iniettate era rilevabile solo una biotinilazione trascurabile. Nelle cellule wild-type, l'aggiunta di biotina supplementare non ha causato biotinilazione rilevabile (Figura 5A). In particolare, la biotina non si stava semplicemente accumulando nel nucleo in via di sviluppo, poiché anche in condizioni di denaturazione, rimane attaccata alle proteine. (Figura 5B). Utilizzando perle magnetiche rivestite di streptavidina, è stato possibile arricchire selettivamente le proteine biotinilate (Figura 6). Le proteine arricchite possono essere identificate utilizzando la spettrometria di massa. In questi successivi esperimenti di identificazione delle proteine, la coltura non integrata, così come le cellule che esprimono una proteina turboID non fusa, possono essere utilizzate come gruppi di controllo di fondo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68504/68504fig1.jpg"> 
Figura 1: Panoramica della procedura per la biotinilazione di prossimità in P. tetraurelia. (A) Schema generalizzato del protocollo. (B) Principio di clonaggio per il vettore ricevente turboID plug-and-play e il costrutto risultante per la proteina di fusione Nowa1. La regione 3'UTR utilizzata in questo plasmide è derivata da CenH3a. (C) Gocciolina diffusa visibile contenuta all'interno dell'area più scura corrispondente al nucleo somatico (MAC) dopo un'iniezione riuscita di DNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68504/68504fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68504/68504fig2.jpg"> 
Figura 2: Test PCR per iniezione riuscita. Analisi su gel di agarosio della reazione PCR per un prodotto con un primer diretto specifico per la regione a monte che codifica per la resistenza all'ampicillina (amp start) e un primer inverso complementare a Nowa1. La punta della freccia mostra le dimensioni previste del prodotto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68504/68504fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68504/68504fig3.jpg"> 
Figura 3: Colorazione in immunofluorescenza per convalidare la corretta localizzazione della proteina di fusione turboID. Colorazione in immunofluorescenza utilizzando anticorpo primario coniglio-anti-HA (1:100) e anticorpo secondario coniugato capra-anti-coniglio Alexa Fluor 568 (1:1000) di linee monoclonali di Paramecium con un segnale PCR positivo per il DNA che codifica per una proteina di fusione Nowa1-HA-turboID. Scala 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68504/68504fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68504/68504fig4.jpg"> 
Figura 4: Biotinilazione specifica di Nowa1 in diversi stadi di sviluppo. Colorazione in immunofluorescenza della linea monoclonale 2 in fasi progressive durante la formazione del nuovo nucleo somatico. Il terreno di coltura è stato integrato con 500 μM di biotina per un'attività turboID ottimale. L'HA-tag è stato rilevato come nella Figura 3 e la biotina è stata rilevata utilizzando la streptavidina-FITC (1:200). Scala 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68504/68504fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68504/68504fig5.jpg"> 
Figura 5: L'efficiente marcatura di prossimità mediante turboID richiede biotina supplementare nella coltura. (A) Colorazione in immunofluorescenza di cellule wt e iniettate nella fase avanzata di sviluppo che mostra l'espressione di Nowa1-HA-turboID e la biotinilazione osservata con 500 μM di biotina supplementare. L'HA-tag e la biotina sono stati rilevati come nella Figura 4. Scala 20 μm. (B) Analisi Western blot per la biotina utilizzando HRP-streptavidina di cellule wt coltivate con 500 μM di biotina e cellule iniettate con turboID con e senza biotina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68504/68504fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68504/68504fig6.jpg"> 
Figura 6: Arricchimento di proteine biotinilate con perline magnetiche di streptavidina. Analisi Western blot per la biotina di campioni provenienti da un esperimento di pulldown utilizzando perle magnetiche rivestite di streptavidina. I campioni sono: Nowa1-HA-turboID lisato cellulare (input), la frazione non legata (flowthrough), le fasi di lavaggio (wash 1-6) e le proteine legate alle perle (output). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68504/68504fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

In vivo Biotinilazione di prossimità per studi di interazione proteica in Paramecium tetraurelia

Paramecium is a major model organism for the study of molecular mechanisms involved in programmed genomic rearrangements and transposon elimination during ...

in-vivo-proximity-biotinylation-for-protein-interaction-studies

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Biochimica

Questo video mostra esperimenti con successiva analisi delle interazioni proteina-proteina mediante l'uso di micro-fantasia superfici. L'approccio offre la possibilità di rilevare le interazioni delle proteine ​​nelle cellule viventi e combina le elevate capacità di throughput con la possibilità di estrarre informazioni quantitative.

In vivo di rilevamento di interazioni proteina-proteina su disegno micro, Superfici

Questo protocollo descrive come immagine interazioni proteina-proteina mediante un saggio basato su FRET prossimità.

Imaging interazioni proteina-proteina In vivo</em

Questo video descrive il saggio di legatura di prossimità per studiare le interazioni proteina-proteina in situ nelle cellule di nematodi. La stretta vicinanza delle proteine di interesse genera il modello circolare di DNA con l'aiuto di una sonda PLA attaccata a un anticorpo secondario. La sonda viene ulteriormente amplificata utilizzando la soluzione di amplificazione, che produce un lungo DNA a filamento singolo seguito dall'ibridazione della sonda del rivelatore, consentendo la...

Saggio di legatura di prossimità per studiare le interazioni proteina-proteina in situ

Qui, descriviamo una procedura per visualizzare e quantificare con alta sensibilità le interazioni endogeni tra il reticolo endoplasmatico e mitocondri nelle cellule fissate. Il protocollo è dotato di un ottimizzato in test legatura situ prossimità targeting inositolo 1,4,5-trifosfato recettore / glucosio-regolata proteina 75 / D complesso canale anionico / cyclophilin voltaggio-dipendente all'interfaccia membrana mitocondriale associata.

Studio del reticolo endoplasmatico e mitocondri interazioni<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity Assay legatura in cellule fissate

Questo manoscritto descrive il protocollo per purificazione di affinità complementazione bimolecolare (BiCAP). Questo metodo novello facilita l'isolamento specifico e caratterizzazione proteomica a valle di qualsiasi due proteine interagenti, mentre escluse ONU-complessato singole proteine, nonché complessi formati con concorrenti partner di legame.

Dissezione multiproteici segnalazione di purificazione di affinità di complementazione bimolecolare (BiCAP)

Qui presentiamo un protocollo per controllare il montaggio e lo smontaggio della tossina antrace tramite interferometria biolayer (BLI). A seguito di montaggio/smontaggio sulla superficie del biosensore, i complessi di grande proteina vengono rilasciati dalla superficie per la visualizzazione e l'identificazione dei componenti dei complessi utilizzando la microscopia elettronica e spettrometria di massa, rispettivamente.

L'analisi di complessi proteici dinamico montato su e rilasciato da Biolayer interferometria biosensore utilizzando la microscopia elettronica e spettrometria di massa

Qui sono presentati protocolli per saggi biochimici in vitro utilizzando etichette di biotina che possono essere ampiamente applicabili per studiare le interazioni proteina-nucleiche dell'acido.

Analisi biochimiche in Vitro che utilizzano etichette di biotina per studiare le interazioni proteina-nucleica dell'acido

Questo protocollo dimostra l'uso del saggio di legatura di prossimità per sondare le interazioni proteina-proteina in situ nella germinale C. elegans.

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly nella C. elegans Germline utilizzando Proximity Ligation Assay

È stato presentato un protocollo per l'imaging dei microtubuli dinamici in vivo utilizzando una proteina legante finale etichettata fluorescentemente. Abbiamo descritto i metodi per etichettare, immaginare e analizzare i microtubuli dinamici nel neurone del microtubulo laterale posteriore (PLM) di C. elegans.

In vivo Valutazione della dinamica e dell'orientamento dei microtubuli nei neuroni della caenorhabditis elegans

Il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET) è una tecnica di imaging per rilevare le interazioni proteiche nelle cellule viventi. Qui viene presentato un protocollo FRET per studiare l'associazione di enzimi modificanti gli istoni con fattori di trascrizione che li reclutano nei promotori bersaglio per la regolazione epigenetica dell'espressione genica nei tessuti vegetali.

Studio delle interazioni tra enzimi modificanti gli istoni e fattori di trascrizione in vivo mediante trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza

In questo studio, abbiamo stabilito un protocollo dettagliato per la marcatura di prossimità (PL) basata su TurboID nell'ovaio di D. melanogaster , coprendo passaggi dall'integrazione di biotina e la dissezione ovarica alla convalida dell'espressione transgenica e all'arricchimento di peptidi biotinilati per la spettrometria di massa.

In vivo Applicazione dell'etichettatura di prossimità basata su TurboID in Drosophila melanogaster

Scopri la biotinilazione di prossimità in vivo per studiare le interazioni proteiche in Paramecium tetraurelia. Questo metodo con turboID consente l'arricchimento selettivo delle proteine biotinilate.

In vivo Biotinilazione di prossimità per studi di interazione proteica in Paramecium tetraurelia

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