Name: Generazione di genomi batterici interi da campioni clinici utilizzando un flusso di lavoro di arricchimento del target (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-15T13:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Scopri il sequenziamento del genoma batterico completo da campioni clinici utilizzando l'arricchimento del target. Questo metodo supera il sequenziamento metagenomico profondo e supporta la sorveglianza epidemiologica delle infezioni sessualmente trasmissibili.

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<ol><li>Lefterova, M. I., Suarez, C. J., Banaei, N., Pinsky, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+for+infectious+disease+diagnosis+and+management%3A+a+report+of+the+Association+for+Molecular+Pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing for infectious disease diagnosis and management: a report of the Association for Molecular Pathology.</a> J Mol Diagn. 17 (6), 623-634 (2015).</li>
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<li>Büttner, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+methods+for+genome+sequencing+of+Chlamydia+trachomatis+and+other+sexually+transmitted+bacteria+directly+from+clinical+swabs%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Genom%22%5BJournal%5D)">Evaluating methods for genome sequencing of Chlamydia trachomatis and other sexually transmitted bacteria directly from clinical swabs.</a> Microb Genom. 11 (2), 001353(2025).</li>
<li>Seth-Smith, H. M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+sequences+of+Chlamydia+trachomatis+directly+from+clinical+samples+without+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Whole-genome sequences of Chlamydia trachomatis directly from clinical samples without culture.</a> Genome Res. 23 (5), 855-866 (2013).</li>
<li>SureSelect XT HS2 DNA kits: library preparation (+/-MBC) / fast-Hyb target enrichment / post-capture pooling workflow for Illumina platform NGS. , Agilent Technologies. 
 <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/G9983-90000.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/G9983-90000.pdf</a> (2023).</li>
<li>Büttner, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydia+trachomatis+genomes+from+rectal+samples%3A+description+of+a+new+clade+comprising+ompA-genotype+L4+from+Argentina%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Genom%22%5BJournal%5D)">Chlamydia trachomatis genomes from rectal samples: description of a new clade comprising ompA-genotype L4 from Argentina.</a> Microb Genom. 11 (2), 001350(2025).</li>
<li>Brown, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norovirus+whole-genome+sequencing+by+SureSelect+target+enrichment%3A+a+robust+and+sensitive+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Norovirus whole-genome sequencing by SureSelect target enrichment: a robust and sensitive method.</a> J Clin Microbiol. 54 (10), 2530-2537 (2016).</li>
<li>Dao, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+SureSelect+target+enrichment+system+for+next-generation+sequencing+to+obtain+the+complete+genome+sequence+of+bovine+leukemia+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Virol%22%5BJournal%5D)">Application of the SureSelect target enrichment system for next-generation sequencing to obtain the complete genome sequence of bovine leukemia virus.</a> Arch Virol. 163 (11), 3155-3159 (2018).</li>
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<li>Büttner, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ompA+sequencing+and+multilocus+sequence+typing+of+lymphogranuloma+venereum+cases+in+Buenos+Aires+reveal+new+Chlamydia+trachomatis+genotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">ompA sequencing and multilocus sequence typing of lymphogranuloma venereum cases in Buenos Aires reveal new Chlamydia trachomatis genotypes.</a> Microorganisms. 12 (3), 587(2024).</li>
<li>La Rosa, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydia+trachomatis+anorectal+infections+by+LGV+%28L1%2C+L2+and+L2b%29+and+non-LGV+serotypes+in+symptomatic+patients+in+Buenos+Aires+Argentina%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+STD+AIDS%22%5BJournal%5D)">Chlamydia trachomatis anorectal infections by LGV (L1, L2 and L2b) and non-LGV serotypes in symptomatic patients in Buenos Aires Argentina.</a> Int J STD AIDS. 32 (14), 1270-1278 (2021).</li>
<li>Rodríguez Fermepin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+than+L2b+in+rectal+lymphogranuloma+venereum%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Microbe%22%5BJournal%5D)">More than L2b in rectal lymphogranuloma venereum.</a> Lancet Microbe. 2 (2), e55(2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>pipetta 8 canali 0,5-10 &; micro; L</td><td>Eppendorf</td><td>3125000010</td><td>Eppendorf Research&nbsp; più, 8 canali, 0,5-10 e micro; L, grigio medio, volume variabile.</td></tr><tr><td>pipetta 8 canali 10-100 &micro; L</td><td>Eppendorf</td><td>3125000036</td><td>Eppendorf Research&nbsp; più, 8 canali, 10-100 e micro; L, giallo, volume variabile.</td></tr><tr><td>Adattatore Oligo Mix per librerie con tag MBC</td><td>Tecnologie Agilent</td><td>5500-0147</td><td>Parte del kit di preparazione della libreria SureSelect XT HS2 per ILM (pre PCR).</td></tr><tr><td>Sistema automatizzato di estrazione dell'acido nucleico con un kit di estrazione del DNA virale/patogeno</td><td>Qiagen</td><td>937036 (kit) / 9001297 (strumento)</td><td>Strumento QIAsymphony SP/AS utilizzato con il kit virus/patogeno QIAamp DSP per l'estrazione automatizzata del DNA.</td></tr><tr><td>Buffer di associazione</td><td>Tecnologie Agilent</td><td>5190-9687</td><td>Parte del kit di arricchimento del bersaglio SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (post PCR).</td></tr><tr><td>Kit di estrazione del DNA e strumento automatizzato</td><td>Società di ricerca Zymo</td><td>D3024/D3025</td><td>Kit Quick-DNA Miniprep utilizzato per l'estrazione totale del DNA da campioni clinici. Compatibile con il flusso di lavoro manuale o automatizzato.</td></tr><tr><td>End Repair: un mix di enzimi di coda</td><td>Tecnologie Agilent</td><td>5500-0147</td><td>Parte del kit di preparazione della libreria SureSelect XT HS2 per ILM (pre PCR).</td></tr><tr><td>Termina la riparazione del buffer di coda</td><td>Tecnologie Agilent</td><td>5500-0147</td><td>Parte del kit di preparazione della libreria SureSelect XT HS2 per ILM (pre PCR).</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>VWR Prodotti chimici BDH</td><td>20816.298</td><td>Etanolo assoluto &ge; 99,5% Ph. Eur., USP</td></tr><tr><td>Fluorimetro con saggio dsDNA ad alta sensibilità / Metodo basato sulla fluorescenza per quantificare il DNA</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>Q33238, Q33231</td><td>Fluorimetro Qubit 4 con kit di test 1X dsDNA ad alta sensibilità (HS).</td></tr><tr><td>Buffer di frammentazione</td><td>Tecnologie Agilent</td><td>5191-4080</td><td>Parte del kit di frammentazione enzimatica SureSelect con il nome ''5X Fragmentation Buffer''.</td></tr><tr><td>Enzima di frammentazione</td><td>Tecnologie Agilent</td><td>5191-4080</td><td>Parte del kit di frammentazione enzimatica SureSelect.</td></tr><tr><td>Tampone DNA polimerasi ad alta fedeltà</td><td>Tecnologie Agilent</td><td>5500-0147</td><td>Parte del kit di preparazione della libreria SureSelect XT HS2 per ILM (Pre PCR) con il nome ''Herculase II Buffer''.</td></tr><tr><td>Tampone DNA polimerasi ad alta fedeltà con dNTP (5X)</td><td>Tecnologie Agilent</td><td>5190-9687</td><td>Parte del kit di arricchimento del bersaglio SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) con il nome ''Herculase II Buffer''.</td></tr><tr><td>Enzima di fusione ad alta fedeltà per l'amplificazione della PCR</td><td>Tecnologie Agilent</td><td>5191-5688</td><td>Parte del kit di arricchimento del bersaglio SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) con il nome ''Herculase II''.</td></tr><tr><td>Tampone di lavaggio ad alta temperatura</td><td>Tecnologie Agilent</td><td>5190-9687</td><td>Parte del kit di arricchimento target SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) con il nome ''Wash buffer 2''.</td></tr><tr><td>Tampone di ibridazione&nbsp;</td><td>Tecnologie Agilent</td><td>5500-0147</td><td>Parte del kit di preparazione della libreria SureSelect XT HS2 per ILM (pre PCR).</td></tr><tr><td>Primer di sequenziamento indicizzati</td><td>Tecnologie Agilent</td><td>5500-0147</td><td>Parte delle coppie di primer indice SureSelect XT HS2 1-96 per ILM (pre PCR).</td></tr><tr><td>Test PCR in tempo reale multiplex interno</td><td>Tib Molbiol</td><td>N/A</td><td>Test sviluppato e accreditato internamente basato su kit Lightmix per il rilevamento di IST</td></tr><tr><td>Tampone di legatura</td><td>Tecnologie Agilent</td><td>5500-0147</td><td>Parte del kit di preparazione della libreria SureSelect XT HS2 per ILM (pre PCR).</td></tr><tr><td>Perline magnetiche per la pulizia</td><td>Tecnologie Agilent</td><td>5191-5740</td><td>Perline SureSelect DNA AMPure XP.</td></tr><tr><td>Supporto magnetico</td><td>Articoli da laboratorio Permagen</td><td>MSRLV08</td><td>0.2mL PCR 8 Separatore Magnetico a Strisce 5 & micro; L ~0,2 ml di volume.</td></tr><tr><td>Sequenziamento di nuova generazione (NGS): sistema di sequenziamento a lettura breve ad alta produttività&nbsp;</td><td>Illumina, Inc.</td><td>N/A</td><td>Sequenziamento paired-end a 150 bp (PE150) eseguito su piattaforme Illumina NextSeq1000 e MiSeq.</td></tr><tr><td>Acqua priva di nucleasi</td><td>Bioconcetto</td><td>3-07F04-H</td><td>Acqua per Biologia Molecolare, senza DNA/DNAsi/RNasi, sterile, senza inibitori della PCR.</td></tr><tr><td>Mix di bloccanti di oligonucleotidi&nbsp;</td><td>Tecnologie Agilent</td><td>5500-0147</td><td>Parte del kit di preparazione della libreria SureSelect XT HS2 per ILM (pre PCR).</td></tr><tr><td>Striscia di provette per PCR</td><td>avantor, consegnato da VWR&nbsp; &nbsp;</td><td>732-3608</td><td>Strisce di provette per PCR con tappi piatti collegati.</td></tr><tr><td>Miscela di primer post-cattura</td><td>Tecnologie Agilent</td><td>5190-9687</td><td>Parte del kit di arricchimento del bersaglio SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (post PCR).</td></tr><tr><td>Sonda per RNA</td><td>Tecnologie Agilent</td><td>5191-6916&nbsp;</td><td>Sonda SureSelect Custom Tier4 6Mb-11.9Mb, ad es. ID progetto S3465164).</td></tr><tr><td>Bloccante della RNasi</td><td>Tecnologie Agilent</td><td>5500-0147</td><td>Parte del kit di preparazione della libreria SureSelect XT HS2 per ILM (pre PCR).</td></tr><tr><td>Tampone di lavaggio a temperatura ambiente</td><td>Tecnologie Agilent</td><td>5190-9687</td><td>Kit di arricchimento target SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) con il nome ''Wash buffer 1''.</td></tr><tr><td>Perline di streptavidina</td><td>Tecnologie Agilent</td><td>5191-5742</td><td>Perline di streptavidina SureSelect.</td></tr><tr><td>T4 DNA ligasi</td><td>Tecnologie Agilent</td><td>5500-0147</td><td>Parte del kit di preparazione della libreria SureSelect XT HS2 per ILM (Pre PCR) .</td></tr><tr><td>Metodo di arricchimento del bersaglio / Metodo di cattura del DNA</td><td>Tecnologie Agilent</td><td>G9983-90000</td><td>Kit DNA SureSelect XT HS2 con preparazione della libreria, arricchimento del target Fast-Hyb e flusso di lavoro di pooling post-acquisizione. Versione del protocollo F0, maggio 2023. Per Illumina Platform NGS</td></tr><tr><td>Sonda di arricchimento target impostata per C. trachomatis, N. gonorrhoeae, T. pallidum e M. genitalium</td><td>Agilent Technologies / Laboratorio di Microbiologia Arricchente (IMM, UZH)</td><td>ID disegno S3465164</td><td>Set di sonde progettato su misura (~242.000 sonde) per la cattura multiplex di quattro agenti patogeni IST. Progettazione basata su più genomi di riferimento.</td></tr><tr><td>Termociclatore</td><td>Thermofischer</td><td>4375305</td><td>Termociclatore a 96 pozzetti Veriti.</td></tr></tbody></table>

generazione di genomi batterici interi da campioni clinici utilizzando un flusso di lavoro di arricchimento del target

Generating Whole Bacterial Genomes from Clinical Samples using a Target Enrichment Workflow

Uno studio sull'epidemia di LGV di C. trachomatis a Buenos Aires, in Argentina, ha mostrato alcune nuove caratteristiche nei campioni, vale a dire, 10 sostituzioni nucleotidiche nel gene ompA rispetto al genotipo L1 di ompA e un'insolita sequenza di tipo 2 Multi-Locus Sequence Typing (MLST)17,18,19. Abbiamo mirato a studiare i genomi di questi campioni clinici, inserendoli nel contesto dei dati globali. Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo confrontato le prestazioni di un approccio di arricchimento target con il sequenziamento metagenomico diretto per WGS di IST batteriche da campioni clinici, nel tentativo di superare le sfide poste da basse cariche batteriche e abbondante DNA umano e microbico.
Il DNA utilizzato proveniva da campioni di tampone rettale raccolti tra il 2017 e il 2023 a Buenos Aires, in Argentina, posti in terreno 2-SP (terreno saccarosio-fosfato) integrati con siero fetale di vitello (FCS) al 2% e antibiotici (gentamicina 25 μg/mL, vancomicina 0,5 mg/mL e amfotericina B 2,5 μg/mL) e conservati a -80 °C, oppure in pool uretrale, anorettale, e tamponi faringei raccolti presso l'Ospedale Universitario di Zurigo (USZ) in tampone NAAT (Nucleic Acid Amplification Tests). Il DNA dai campioni di Buenos Aires è stato estratto utilizzando un kit di estrazione manuale a base di silice, mentre il DNA dai campioni USZ è stato estratto utilizzando un sistema automatizzato basato su microsfere magnetiche.
Tutti i campioni clinici inclusi in questo studio sono stati confermati positivi da un test PCR multiplex in tempo reale sviluppato internamente (vedi Tabella dei materiali) con valori di soglia del ciclo qPCR (Ct) che variano come segue: C. trachomatis: 17-34, N. gonorrhoeae: 24-31, T. pallidum: 27-36 e M. genitalium: 30-37. La concentrazione di DNA è stata quantificata utilizzando un test fluorimetrico ad alta sensibilità prima del sequenziamento per caratterizzare il materiale in ingresso dei campioni clinici (vedi Tabella dei materiali).
Per confrontare il sequenziamento metagenomico diretto con l'arricchimento del bersaglio, abbiamo utilizzato 32 campioni, di cui 29 erano positivi per C. trachomatis, nove per N. gonorrhoeae, cinque per T. pallidum e tre per M. genitalium. Il sequenziamento metagenomico diretto non ha portato ad alcun genoma completo e anzi ha raggiunto a malapena i dati target al di sopra del basale osservato nei campioni negativi. L'arricchimento del bersaglio con ibridazione a 65 °C ha portato a risultati di gran lunga migliori per ciascun patogeno e in molti casi sono stati ottenuti genomi di successo con questo metodo (Figura 1). 
Per valutare la selezione ottimale del campione per l'arricchimento target, abbiamo valutato la relazione tra i valori diagnostici di qPCR Ct e l'efficienza del recupero del genoma, misurata dalla percentuale di letture on-target (%OTR). Questa metrica riflette la proporzione di letture di sequenziamento che mappano il genoma dell'organismo bersaglio ed è comunemente utilizzata per valutare le prestazioni di arricchimento. È stata trovata una correlazione significativa tra il carico patogeno e il successo del sequenziamento per C. trachomatis, con un cut-off Ct per il successo intorno a Ct30. Sebbene i dati per gli altri patogeni bersaglio fossero limitati, è stata osservata una tendenza simile, in cui il successo del sequenziamento del genoma si è verificato prevalentemente in campioni con carico patogeno inferiore a Ct30 (Figura 2).
Questo esperimento con una temperatura di ibridazione di 65 °C ha fornito tassi di successo del sequenziamento del genoma con un arricchimento target del 75%-80% per C. trachomatis, N. gonorrhoeae e T. pallidum, sulla base di campioni con valori di Ct inferiori a 30. I tre campioni positivi di M. genitalium avevano valori Ct di 30-37 e hanno raggiunto una copertura genomica e una profondità di lettura media inferiori. Al fine di migliorare questi risultati, abbiamo sperimentato la riduzione della temperatura di ibridazione, che migliora l'ibridazione a causa del basso contenuto di %G+C nel genoma di M. genitalium . Utilizzando temperature di ibridazione più basse, come la temperatura ora raccomandata di 62,5 °C, possiamo migliorare il recupero dei genomi di M. genitalium senza compromettere il recupero di altri genomi (Figura 3). Questi risultati dimostrano che l'arricchimento del bersaglio è un approccio efficace per ottenere preziose informazioni genomiche da campioni clinici e può essere adattato a un'ampia gamma di genomi, anche attraverso un disegno basato su pannelli.
L'analisi filogenetica dei genomi arricchiti con successo di C. trachomatis ha mostrato che la maggior parte dei campioni di Buenos Aires si raggruppa all'interno del clade ompA-genotipo L2b, suggerendo un lignaggio di successo con circolazione globale. L'analisi ha anche rivelato la presenza di un nuovo lignaggio distinto in Argentina, che causa l'LGV. I campioni di questo clade differiscono di circa 600 SNP dagli altri lignaggi LGV, e questo lignaggio è proposto come ompA-genotipo L4 (Figura 4). Una descrizione dettagliata dei campioni utilizzati nella Figura 1, Figura 2 e Figura 4 è fornita nella Tabella supplementare 1.
Questi risultati sottolineano il valore dell'arricchimento del bersaglio nello studio della diversità dei patogeni e dimostrano un alto grado di successo del sequenziamento del genoma da campioni clinici.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68506/68506fig1.jpg"> 
Figura 1: Arricchimento dei genomi utilizzando l'arricchimento del bersaglio rispetto al sequenziamento metagenomico diretto. La percentuale di reads on-target (%OTR), definita come la percentuale di reads di sequenziamento mappate sul genoma dell'organismo target, mostra il grado di arricchimento raggiunto con l'arricchimento target. La linea rappresenta la mediana di tutti i punti dati e la casella indica l'intervallo interquartile (IQR) del 50%. I colori dei punti dati corrispondono alla fonte del campione: azzurro pallido per l'Argentina e rosso per la Svizzera. Il successo del sequenziamento del genoma, definito come copertura &gt;95% e profondità media di lettura &gt;10, è rappresentato da punti grandi, mentre il fallimento è indicato da punti piccoli. Notare le diverse scale sull'asse y. Abbreviazioni: CT = C. trachomatis, NG = N. gonorrhoeae, TP = T. pallidum, MG = M. genitalium. Questa cifra è stata modificata da10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68506/68506fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68506/68506fig2.jpg"> 
Figura 2: Correlazione della %OTR dall'arricchimento del target con i valori diagnostici di qPCR Ct. I colori dei punti dati rappresentano la fonte del campione: azzurro pallido per l'Argentina e rosso per la Svizzera. Il successo del sequenziamento del genoma, definito come copertura &gt;95% e profondità media di lettura &gt;10, è indicato da punti grandi, mentre il fallimento è rappresentato da punti piccoli. Notare le diverse scale sull'asse y. Abbreviazioni: CT = C. trachomatis, NG = N. gonorrhoeae, TP = T. pallidum, MG = M. genitalium. Questa cifra è stata modificata da10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68506/68506fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68506/68506fig3.jpg"> 
Figura 3: Effetto della temperatura di ibridazione sul recupero di genomi completi in tutti i patogeni batterici IST in dieci campioni. Il DNA umano nell'intervallo di quello nei campioni clinici è stato addizionato con concentrazioni note di DNA batterico bersaglio separatamente (singolo) e anche complessivamente per rappresentare un campione con infezioni multiple (aggregato). Sono stati eseguiti due esperimenti, ciascuno con i cinque patogeni/combinazioni: 0,01% e 0,03% per rappresentare la percentuale approssimativa di DNA di ciascun microrganismo rispetto al DNA totale nel campione (il DNA rimanente corrisponde al DNA umano). Il recupero di M. genitalium è migliorato a temperature più basse. C. trachomatis Il DNA è stato addizionato a una bassa concentrazione; ulteriori esperimenti dimostrano che le temperature non hanno influenzato il recupero dei genomi di C. trachomatis (dati non mostrati). Abbreviazioni: CT = C. trachomatis, MG = M. genitalium, NG = N. gonorrhoeae, TP = T. pallidum. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68506/68506fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68506/68506fig4.jpg"> 
Figura 4: Filogenesi aggiustata per la ricombinazione di ceppi di LGV provenienti dall'Argentina. L'analisi include tutti i genomi LGV disponibili con i dati pubblicati. I metadati visualizzati a destra della filogenesi includono campioni di pazienti duplicati, analisi bayesiana della struttura della popolazione (BAPS; cluster = clade, con il cluster polifiletico BAPS 6 che rappresenta la diversità genetica della popolazione), metodo di sequenziamento del genoma (dati di questo studio), genotipo ompA , paese e anno, come indicato nella chiave in alto a sinistra. I dati mancanti vengono visualizzati in bianco. I nomi dei genomi di questo studio sono evidenziati in blu chiaro per l'Argentina e in blu scuro per la Finlandia (non ottenuti mediante arricchimento del bersaglio). Questi colori sono utilizzati esclusivamente per distinguere i genomi generati in questo studio. I valori di bootstrap di 1000 bootstrap ultraveloci vengono visualizzati come percentuali sui rami principali. Questa cifra è stata modificata da13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68506/68506fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tabella supplementare 1: Descrizione dei materiali, dei reagenti, degli strumenti e delle attrezzature utilizzati nello studio. La tabella include informazioni dettagliate sul nome commerciale, il produttore e il numero di catalogo dei componenti utilizzati per l'estrazione del DNA, la preparazione della libreria, l'arricchimento del bersaglio e il sequenziamento. Include anche articoli utilizzati per i saggi qPCR interni e le procedure di biologia molecolare generale. Alternative equivalenti possono essere utilizzate per gli articoli contrassegnati da un asterisco (*). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68506/Supplementary_Table_1_RE.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>

Generazione di genomi batterici interi da campioni clinici utilizzando un flusso di lavoro di arricchimento del target

Obtaining complete genomes of bacterial sexually transmitted infections (STIs) directly from clinical samples is challenging due to the presence of human ...

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Descriviamo una metodologia per effettuare l'analisi genetica in Chlamydia sulla base di mutagenesi chimica e il sequenziamento dell'intero genoma. Inoltre, un sistema di scambio di DNA all'interno delle cellule infettate è descritto che può essere utilizzato per la mappatura genetica. Questo metodo può essere ampiamente applicabile a sistemi microbici privi sistemi di trasformazione e strumenti genetici molecolari.

Approcci genetici in avanti<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

l'arricchimento del gDNA per il sequenziamento NGS è uno strumento facile e potente per lo studio delle mutazioni costituzionali. In questo articolo, presentiamo la procedura per analizzare semplicemente la sequenza completa di 11 geni coinvolti nella riparazione del danno al DNA.

gDNA arricchimento da una tecnologia basata trasposasi-NGS per l'analisi della sequenza intera BRCA1, BRCA2, e 9 geni coinvolti nella riparazione del DNA Damage

Viene descritto un sistema integrato per il sequenziamento mirato di nuova generazione di campioni oncologici. Questo sistema multipiattaforma è ottimizzato per biopsie tumorali di bassa qualità e bassa quantità, accoglie bassi input di DNA, include controlli multivariante ben caratterizzati e presenta un nuovo chiamante di varianti informato da misure quantitative di controllo di qualità pre-analitiche.

Integrazione di Wet and Dry processi banco Ottimizza Targeted sequenziamento di prossima generazione di bassa qualità e di biopsie di tumori a bassa quantità

Descriviamo un metodo efficiente, robusto e redditizio per l'estrazione degli acidi nucleici da tamponi per la caratterizzazione delle comunità batteriche che utilizzano 16S rRNA gene amplicone sequenziamento. Il metodo consente un approccio di elaborazione comune per diversi tipi di campioni ed accoglie una serie di processi analitici valle.

Efficiente Nucleic Acid Estrazione e 16S rRNA sequenziamento del gene per batterica Comunità Caratterizzazione

Qui vi presentiamo un protocollo per indagare genoma metilazione del DNA in studi clinici di screening dei pazienti su larga scala utilizzando il metil-Binding sequenziamento del DNA di cattura (MBDCap-ss o MBD-ss), la tecnologia e la successiva analisi bioinformatica pipeline.

Metil-binding cattura sequenziamento del DNA per tessuti del paziente

Questo protocollo è quello di recuperare e preparare cellule bersaglio rara da una miscela con cellule non-bersaglio della priorità bassa per la caratterizzazione genetica molecolare a livello di singola cellula. Qualità del DNA è uguale a cellule singole non trattata e permette per cella singola applicazione (entrambi screening basato e analisi mirate).

Amplificazione dell'obiettivo delle cellule pre-arricchimento e intero genoma per singola cella a valle caratterizzazione

Questo manoscritto descrive un dettagliato protocollo standardizzato di alta-16S rRNA-amplicone sequenziamento. Il protocollo introduce un protocollo integrato, in uniforme, fattibile ed economico a partire dalla raccolta del campione fecale attraverso l'analisi dei dati. Questo protocollo consente l'analisi di un gran numero di campioni con rigorosi standard e diversi controlli.

Protocollo guidata per caratterizzazione microbica fecale mediante sequenziamento del 16S rRNA-amplicone

Questo protocollo descrive un approccio completo per la coltura, il sequenziamento e l'assemblaggio del genoma ibrido de novo dei batteri urinari. Fornisce una procedura riproducibile per la generazione di sequenze genomiche circolari complete utili nello studio di elementi genetici sia cromosomici che extracromosomiali che contribuiscono alla colonizzazione urinaria, alla patogenesi e alla diffusione della resistenza antimicrobica.

Assemblaggio di genoma ibrido De Novo per la generazione di genomi completi di batteri urinari utilizzando tecnologie di sequenziamento a lettura breve e lunga

La fattibilità di strategie di sequenziamento dell'intero genoma (WGS) utilizzando strumenti da banco ha semplificato l'interrogazione del genoma di ogni microbo di rilevanza per la salute pubblica in un ambiente di laboratorio. Viene descritto un adattamento metodologico del flusso di lavoro per WGS batterico e viene inoltre presentata una pipeline bioinformatica per l'analisi.

Caratterizzazione di un ceppo patogeno di Escherichia coli derivato da allevamenti di Oreochromis spp. che utilizzano il sequenziamento dell'intero genoma

La metaproteomica clinica offre approfondimenti sul microbioma umano e sui suoi contributi alla malattia. Abbiamo sfruttato la potenza computazionale della piattaforma Galaxy per sviluppare un flusso di lavoro bioinformatico modulare che facilita l'analisi metaproteomica complessa basata sulla spettrometria di massa e la caratterizzazione di diversi tipi di campioni clinici rilevanti per gli studi sulla malattia.

Un flusso di lavoro di metaproteomica clinica implementato all'interno della piattaforma Galaxy Bioinformatics per analizzare le interazioni ospite-microbioma alla base della malattia umana

Lo studio attuale descrive un flusso di lavoro per il sequenziamento nanoporo dei plasmidi quando la sequenza cromosomica è già nota o non ha alcun interesse. Un primo passaggio di arricchimento del DNA plasmidico garantisce una profondità ottimale della sequenza plasmidica e massimizza il numero di campioni che possono essere sequenziati per cella di flusso.

Sequenziamento e assemblaggio di plasmidi a lunga lettura utilizzando flussi di lavoro basati sul sequenziamento nanopore

Scopri il sequenziamento del genoma batterico completo da campioni clinici utilizzando l'arricchimento del target. Questo metodo supera il sequenziamento metagenomico profondo e supporta la sorveglianza epidemiologica delle infezioni sessualmente trasmissibili.

Generazione di genomi batterici interi da campioni clinici utilizzando un flusso di lavoro di arricchimento del target

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