Generazione di genomi batterici interi da campioni clinici utilizzando un flusso di lavoro di arricchimento del target

I genomi possono fornire informazioni sull'ascendenza, la trasmissione e le capacità di un agente patogeno. Per i batteri non coltivabili, queste informazioni possono essere ottenute solo attraverso l'arricchimento del bersaglio. Il sequenziamento dei patogeni batterici direttamente dai campioni clinici è impegnativo a causa della travolgente quantità di DNA umano, del microbiota diversificato e delle cariche batteriche estremamente basse.

In molti casi, la coltura non è un'opzione, a causa del metodo di campionamento e dei batteri esigenti. Applicando questa tecnologia ai batteri a trasmissione sessuale, abbiamo scoperto un nuovo lignaggio LGV di Chlamydia trachomatis chiamato ompA-genotipo L4 e abbiamo confermato l'espansione globale del lignaggio LGV dominante, fornendo informazioni chiave per la diagnostica molecolare e la sorveglianza epidemiologica. Questo protocollo di arricchimento dei progressi consente il recupero completo del genoma da campioni clinici di IST diagnosticati positivi.

Abbiamo scoperto che questa tecnica supera il sequenziamento profondo metagenomico, la deplezione del DNA dell'ospite e il sequenziamento adattivo dei nanopori. Stiamo studiando i ceppi circolanti di questi agenti patogeni in tutta Europa e in Argentina. Questo ha il potenziale per informare sulla trasmissione e sulla gestione antimicrobica.

Per iniziare, misurare la concentrazione di DNA degli estratti di DNA da campioni clinici utilizzando un metodo sensibile e accurato basato sulla fluorescenza. Diluire ogni campione di DNA utilizzando acqua priva di nucleasi a 10-200 nanogrammi in un volume finale di 17 microlitri in ciascuna striscia di provette PCR. Aggiungere 3 microlitri di master mix di frammentazione a ciascun pozzetto contenente i 17 microlitri di DNA diluito.

Pipettare su e giù 20 volte per miscelare accuratamente. Quindi, sigillare la striscia della provetta per PCR. Agitare la striscia ad alta velocità per 10 secondi e girare brevemente per raccogliere il contenuto.

Quindi, posizionare la striscia di provette per PCR nel termociclatore e avviare il protocollo pre-programmato per la frammentazione e l'incubazione. Successivamente, preparare la riparazione finale e la miscela master dA-tailing come mostrato nella tabella. Agitare e far girare il tubo come mostrato in precedenza e tenerlo sul ghiaccio.

Quindi, pipettare 20 microlitri della miscela master di riparazione finale e dA-tailing in ciascun pozzetto contenente 50 microlitri di frammenti di DNA. Sigillare la striscia e vorticare ad alta velocità per otto secondi. Dopo aver fatto girare brevemente la striscia, reinserirla nel termociclatore.

Una volta terminato il programma del termociclatore, posizionare la striscia di provette per PCR sul ghiaccio. Quindi, aggiungere 25 microlitri di master mix di legatura a temperatura ambiente, che è stato preparato da 30 a 45 minuti in anticipo in ogni pozzetto contenente i frammenti di DNA. Aggiungere 5 microlitri di miscela di oligo adattatore per librerie con tag NBC a ciascun pozzetto.

Riposizionare immediatamente la striscia di provette per PCR nel termociclatore e continuare il programma. Per iniziare la purificazione del DNA, recuperare le perle magnetiche da 4 gradi Celsius e lasciarle raggiungere la temperatura ambiente prima dell'uso. Quindi, aggiungere 80 microlitri a ciascun pozzetto del campione.

Posizionare la striscia di provette per PCR sul supporto magnetico e lavare ogni pozzetto due volte con 200 microlitri di etanolo al 70%. Attendere un minuto durante ogni lavaggio e rimuovere con cura l'etanolo senza disturbare le perle magnetiche. Dopo aver mescolato e incubato le perle con 35 microlitri di acqua priva di nucleasi per cinque minuti, aspirare con cura il surnatante eliminato da ciascun pozzetto e trasferirlo in un pozzetto corrispondente in una nuova striscia di provette per PCR.

Posizionare la nuova striscia di provette per PCR sul ghiaccio e gettare le perle magnetiche. Prelevare la miscela di reazione PCR pre-ricattura preparata e aggiungerne 11 microlitri in ogni pozzetto del campione contenente la libreria di DNA purificato. Aggiungere 5 microlitri dell'indice di prima riparazione selezionato a ciascuna reazione e sigillare la striscia della provetta PCR.

Avviare il programma del termociclatore per l'amplificazione della PCR come specificato nella tabella per eseguire la PCR pre-cattura. Aggiungere la striscia di provette PCR solo dopo che il termociclatore ha raggiunto i 98 gradi Celsius. Dopo aver completato la PCR pre-acquisizione, eseguire un'altra pulizia basata su microsfere per purificare la libreria.

Incubare il prodotto della PCR con perle magnetiche. Quindi, posizionare la provetta della striscia PCR su un dispositivo di separazione magnetico e attendere da 5 a 10 minuti fino a quando la soluzione diventa limpida. Mentre la striscia rimane sul supporto magnetico, rimuovere con cautela ed eliminare il surnatante trasparente da ciascun pozzetto.

Quindi, eluire il DNA in 15 microlitri di acqua priva di nucleasi e misurare la concentrazione di DNA nella libreria di DNA purificato. Per l'ibridazione del campione, programmare il termociclatore secondo il protocollo qui specificato. Avviare il programma e mettere immediatamente in pausa la corsa.

Diluire da 500 a 1.000 nanogrammi delle librerie di DNA preparate fino a un volume finale di 12 microlitri utilizzando acqua priva di nucleasi. Dopo aver agitato e fatto girare la miscela bloccante degli oligonucleotidi, aggiungere 5 microlitri a ciascuna provetta del campione. Sigillare la striscia di provette per PCR e posizionarla nel termociclatore.

Mettere in pausa il termociclatore quando raggiunge il passaggio tre del protocollo. Aggiungere 13 microlitri della miscela di ibridazione della sonda a temperatura ambiente preparata a ciascun campione, mantenendo la striscia all'interno del termociclatore. Pipettare lentamente su e giù da 8 a 10 volte per mescolare.

Assicurarsi che non siano presenti bolle d'aria e riposizionare la striscia nel termociclatore. Quindi, verificare che tutte le provette siano sigillate ermeticamente. Per catturare la libreria ibridata, trasferire l'intero volume da ciascuna provetta alle provette corrispondenti contenenti 200 microlitri di perle di streptavidina prelavate.

Raccogliere le perle di streptavidina prima di lavarle con un tampone di lavaggio a temperatura ambiente. Una volta rimossa la striscia di provette per PCR dal separatore magnetico, aggiungere 200 microlitri di tampone di lavaggio ad alta temperatura preriscaldato a 70 gradi Celsius e risospendere le perle pipettando su e giù. Sigillare la striscia del tubo, vorticare ad alta velocità e girare rapidamente come dimostrato in precedenza.

Posizionare la striscia di provetta sigillata nel blocco del termociclatore a 70 gradi Celsius e incubare per 5 minuti. Trasferire la striscia di provette per PCR dal termociclatore al separatore magnetico a temperatura ambiente. Attendi un minuto finché la soluzione non diventa limpida.

Quindi, rimuovere con cura e gettare il surnatante. Quindi, aggiungere 25 microlitri di acqua priva di nucleasi a ciascun tubo contenente le perline. Programmare il termociclatore come specificato nella tabella riportata di seguito.

Aggiungere 25 microlitri della miscela di reazione PCR post-cattura preparata in ciascuna provetta del campione. Mescolare la reazione fino a quando la sospensione è uniforme e sigillare saldamente la striscia di provette per PCR senza farla girare verso il basso. Posizionare la striscia di provette PCR sigillata nel termociclatore.

Dopo aver trasferito il prodotto della PCR in una nuova provetta, aggiungere 50 microlitri di sospensione di perline a ciascuna provetta del campione ed eseguire la pulizia del DNA come mostrato in precedenza. Misurare la concentrazione di DNA del DNA della libreria purificato finale utilizzando un metodo di quantificazione basato sulla fluorescenza. L'arricchimento del bersaglio ha portato a percentuali significativamente più elevate di letture sul bersaglio e quindi a genomi completi rispetto al sequenziamento diretto di tutti i patogeni testati, tra cui Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum e Mycoplasma Genitalium.

Il successo del sequenziamento del genoma è stato osservato prevalentemente in campioni con valori di soglia del ciclo qPCR inferiori a 30 per tutti e quattro i patogeni. Con una chiara correlazione inversa tra i valori CT e la percentuale di letture on-target per Chlamydia trachomatis. Utilizzando una temperatura di ibridazione di 62,5 gradi Celsius rispetto ai precedenti 65 gradi Celsius, è stata migliorata la copertura del genoma per il mycoplasma genitalium senza ridurre le prestazioni degli altri patogeni bersaglio.

L'analisi filogenetica dei genomi di Chlamydia trachomatis provenienti dall'Argentina ha mostrato che molti campioni si raggruppano all'interno del clade L2b e ha rivelato un nuovo lignaggio proposto come ompA-genotipo L4 separato da tutti i precedenti genomi LGV da circa 600 polimorfismi a singolo nucleotide.