Tomografia al microscopio elettronico a scansione a trasmissione in virologia: imaging 3D di campioni congelati ad alta pressione, liofilizzati

L'infezione virale potrebbe causare cambiamenti significativi nell'infrastruttura cellulare. Per visualizzare questi cambiamenti in tre dimensioni, utilizziamo la tomografia STEM per l'imaging delle cellule infette da virus. La tomografia STEM richiede tempo e richiede molta fatica.

Questo rende essenziale una preparazione ottimale del campione per campioni biologici, come i set infettati da virus. La tomografia STEM convenzionale è limitata a malattie di campioni di circa 200 nanometri. Il nostro protocollo consente l'imaging 3D di sezioni più spesse.

Questo permette una visualizzazione più completa delle cellule infette da virus e delle alterazioni ultra strutturali. Molti virus oncolitici sono originariamente già sperimentati clinicamente, perciò ricercatori e sviluppatori in tutto il mondo che lavorano insieme, e la scienza sta spingendo i confini del trattamento del cancro e metodi all'avanguardia, come la microscopia elettronica e la tomografia STEM, contribuiscono con nuove intuizioni. Continueremo a rispondere a domande virologiche utilizzando la tomografia STEM e combinandola con nuovi protocolli di preparazione e altre tecniche di microscopia.

Per iniziare, riempire la scatola LN con azoto liquido in preparazione alla manipolazione e al trasferimento dei dischi di zaffiro congelati dal supporto di congelamento ad alta pressione o HPF alle capsule di stoccaggio. Tieni a portata di mano un dewar riempito di azoto liquido per ricaricare la scatola LN quando necessario durante il congelamento. Tieni a portata di mano un paio di pinzette isolante.

Prepara i contenitori per campioni che conterranno i dischi di zaffiro dopo l'HPF. Assicurati che abbiano un coperchio e diversi fori per far versare l'azoto liquido e piccoli pesi per evitare che galleggino. Metti il contenitore dell'etichetta nella scatola LN per farlo preraffreddare prima di usarlo.

Poi, metti i campioni nell'incubatrice. Ispezionare i dischi di zaffiro sotto un microscopio a luce invertita per assicurarsi che ci siano abbastanza cellule e una buona qualità cellulare prima di iniziare il congelamento ad alta pressione. Per eseguire l'HPF, prendi un disco di zaffiro dalla tavola di coltura e tamponalo rapidamente sulla carta filtrante per rimuovere il materiale in eccesso.

Posiziona il disco nel porta-HPF con il lato rivestito di carbonio rivolto verso l'alto, assicurandoti che il numero due sia leggibile. Immergi un distanziatore dorato nell'esadecano e posizionalo delicatamente sul disco di zaffiro. Posiziona un secondo disco di zaffiro sopra il distanziatore con il lato rivestito al carbonio rivolto verso il basso per formare una configurazione a sandwich con le celle rivolte l'una verso l'altra, assicurandoti che non ci sia aria intrappolata.

Chiudi con attenzione e rapidità il portaHPF per ridurre lo stress sul campione. Inserisci il portaHPF nel congelatore ad alta pressione. Bloccalo secondo le istruzioni del produttore e avvia il processo di congelamento.

Successivamente, trasferire il porta-HPF nella scatola LN. Poi trasferisci la punta che contiene i dischi zaffiro nella scatola LN pre-raffreddata. Estraete con cura i dischi dal supporto.

Inserire le fiale criogeniche chiuse riempite con soluzione di libera sostituzione in un dispositivo di libera sostituzione pre-raffreddato a meno 90 gradi Celsius. Aspetta che la soluzione raggiunga la stessa temperatura. Pre-raffreddare pinzette, bisturi e pinze o pinzette grandi immergendole in azoto liquido per il trasferimento dei dischi di zaffiro.

Trasferire i campioni congelati ad alta pressione nel dispositivo di sostituzione libera. Separare i dischi di zaffiro uno per uno, mantenendoli nell'azoto liquido. E trasferire rapidamente ogni disco singolarmente in una fiala criogenica con soluzione di sostituzione libera, assicurandosi che il disco sia completamente immerso.

Dopo aver chiuso la fiala criogenica, rimettila immediatamente nel dispositivo di sostituzione libera. Una volta che tutti i campioni sono stati posizionati, si avvia il processo di sostituzione. Non appena i campioni raggiungono i 20 gradi Celsius.

Continua lavando i campioni tre volte per 30 minuti ciascuno con acetone al 100%. Per pre-infondere i campioni, incubare i campioni in un terzo di resina epossidica e due terzi di acetone per un'ora. Dopo aver incubato i campioni con due terzi di resina epossidica e un terzo di acetone per un'ora, si scambia la soluzione con resina epossidica al 100% e si incova durante la notte con il coperchio della fiala aperto per permettere l'evaporazione dell'acetone residua il giorno seguente, trasferire i dischi di zaffiro in nuovi tubi di reazione etichettati riempiti con resina epossidica appena preparata.

Posiziona i dischi orizzontalmente sostenuti dalla parete del tubo, assicurandoti che il lato con le celle sia rivolto verso l'alto. Poi posiziona i tubi di reazione con i coperchi aperti in un forno impostato a 60 gradi Celsius e lascia polimerizzare la resina per almeno 48 ore. Dopo che la resina epossidica si è polimerizzata, immergi la punta di un tubo di reazione chiuso nell'azoto liquido per circa 10 secondi.

Colpisci il tubo di reazione su un tavolo per liberare il blocco di resina. Il disco di zaffiro si separerà facilmente dal rivestimento di carbonio, che rimane attaccato alle celle incorporate. Seleziona la regione di interesse nel campione incorporato e restringi la dimensione del campione alla regione di interesse.

Utilizzando un ultramicrotono con un coltello diamantato, raccogli sezioni di circa un micrometro di spessore su una griglia a barre parallele caricate con Poly-L-lysine per imaging STEM e tomografia STEM. Tratta le sezioni con oro colloidale come marcatori fiduciari e applica un rivestimento al carbonio. Dopo aver tagliato e ispezionato le sezioni ultrasottili, i campioni sono pronti per l'imaging (imaging).

In base alla domanda di ricerca, inserisci o il rilevatore di campo chiaro, il rilevatore di campo oscuro, o entrambi. Attiva la modalità scansione e acquisisci un'immagine di prova del campione. Seleziona un ingrandimento superiore a 800.000 volte, che è superiore all'ingrandimento finale desiderato.

Vicino alla regione di interesse, regolare la messa a fuoco e correggere l'astigmatismo evitando l'esposizione diretta al fascio sulle aree critiche del campione. Imposta l'altezza eccentrica in modo che la regione di interesse, o ROI, rimanga centrata lungo tutto l'intervallo di inclinazione. Scegli una caratteristica vicino al ROI, portala al centro, metti a fuoco, correggi l'astigmatismo e inclina il palco a passo in passo a meno 72 gradi.

Per scegliere il campo visivo, torna al ROI, mettilo a fuoco e cattura un'immagine panoramica. Imposta l'ingrandimento finale desiderato per l'acquisizione in serie di inclinazione. Imposta l'acquisizione automatica in serie di inclinazione delle immagini, che va da meno 72 gradi a più 72 gradi e l'immagine ogni 1,5 gradi.

Avvia l'acquisizione automatica in serie di inclinazione. Slice virtuali rappresentative dal termogramma STEM hanno illustrato come l'orientamento dei virioni influenzi la visibilità della forma caratteristica del proiettile in viste bidimensionali. Solo virioni allineati paralleli al piano di osservazione apparivano con la morfologia completa del proiettile ben definita, mentre altri apparivano circolari o allungati, a seconda dell'angolo di inclinazione.

Per superare le limitazioni di orientamento dell'imaging 2D, la tomografia STEM è stata utilizzata per catturare grandi gruppi di virione virale della stomatite vesicolare ricombinante in germogliamento, permettendo la valutazione della forma del virone in tre dimensioni senza bias direzionali. La vista laterale del termogramma ha confermato il vantaggio volumetrico della tomografia STEM nel catturare molti virioni completi all'interno di una singola sezione spessa 600 nanometri, in contrasto con il campionamento limitato possibile con una sezione TEM da 200 nanometri.