Name: Optik Görüntüleme ile non-invaziv Algılama için Floresan Boyalar Kök Hücreler Etiketleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-04-02T18:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Öğrenin, insan embriyonik kök hücreleri ve mezenkimal kök hücreleri floresan boyalarla etiketleme yöntemini. Optik görüntüleme ile non-invaziv izleme sağlar ve rejeneratif tıpta hücre davranışlarını anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu proje için California Rejeneratif Tıp Enstitüsü bir Leon J. Thal TOHUM hibe ile desteklendi. Tobias Henning, Alman Araştırma Birliği (DFG, HE 4578/1-2) nakit Araştırma tarafından finanse edildi. Biz insan embriyonik kök hücre kültürü onun tavsiye Juanito Meneses minnetle kabul etmek istiyorum.

Floresan boya ile mezenkimal kök hücrelerin Etiketleme DID <ol><li> Mezenkimal kök hücreleri etiketleme prosedürü başlatmak için, trypsinize ve hücrelerin belirli bir sayı ile bir süspansiyon elde etmek için hücre sayımı. </li><li> Kuluçka hücreleri ve etiketli hücreleri içeren şişeler eski medya aspirat </li><li> Mg / Ca-free PBS 10 ml hücreleri yıkayın. PBS aspire. Mg ve Ca tripsin inhibe eder, bu nedenle biz bu olmadan PBS kullanabilirsiniz. </li><li> 5ml kullanan T75 şişesi için, önceden ısıtılmış% 0.05 tripsin ekleyin. Balonun tüm yüzeyi kaplı olduğundan emin olun. </li><li> Yaklaşık 5 dakika için 37 ° C inkübatör &#39;da inkübe edin. </li><li> Mikroskop altında dekolmanı onaylayın. Hücreleri hala balona bağlı ise, birkaç kez dokunun ve trypsinization başarılı oluncaya kadar biraz daha bekleyin. </li><li> Şimdi,% 10 FCS içeren medya ekleyerek tripsin nötralize etmek için gerekli. Tripsin var olduğu gibi bir ortam eşit miktarda kullanın. </li><li> Olduğunu tüm hücreleri medyada tekrar askıya sağlamak için birkaç kez aşağı yukarı Pipet. </li><li> Hücre çözümü 15ml steril kapaklı polipropilen tüp aktarın. </li><li> 5 dakika boyunca 400 RCF santrifüjleyin. </li><li> Hücre pelletini rahatsız etmeyecek şekilde sağlanması süpernatantı aspire. </li><li> DMEM hücrelerin yeniden süspanse edin ve hücre sayımı ile devam edin. </li><li> ^ 6 ml serum serbest kültür vasatı (DMEM) başına 1x10 yoğunluğu etiketlenmesine hücreleri askıya alınması. </li><li> Bu hücre süspansiyonu tüm hazırlık oldu. Şimdi, etiketleme başlamak için hazır. </li><li> İlk olarak, hücre süspansiyonu ml başına kontrast madde 5 mcL ekleyin. </li><li> Sonra, yavaşça pipetleme çözüm karıştırın. </li><li> Etiketleme çözümü 37 ° C de 20 dakika 6-iyi bir düşük-attachment çanak hücreleri inkübe edin. </li><li> Basit inkübasyon tamamlandıktan sonra, 15 ml kapaklı polipropilen tüp hücre çözümü aktarmak için gereklidir. </li><li> 5 dakika boyunca 400 RCF santrifüjleyin. </li><li> Hücre pelletini rahatsız sağlanması, etiketleme orta aspire edin. </li><li> Hücreler PBS ile yıkayın. Hücreler yukarı ve aşağı Pipet, hücre pelletini break up emin olun. </li><li> Son iki adımı iki kez daha tekrarlayın, bu nedenle bir toplam 3 yıkama adımları var. </li><li> Hücre sayımı ve hücre canlılığını belirlemek için bir Tripan mavi testi gerçekleştirin. Bunlar, standart hücre kültürü protokolleri burada anlatmayacağım olduğunu. </li><li> Hücreler artık optik görüntüleyici görüntülü hazır. </li></ol> Floresan boya ICG ile insan embriyonik kök hücreleri Etiketleme <ol><li> Insan embriyonik kök hücreleri etiketleme prosedürü başlatmak için, kontrast madde Yeşil İndosiyanin hazırlamak. Transfeksiyon ajan Protamin ile karıştırın. </li><li> İndosiyanin Yeşil toz 1mg ölçün. Dimetil sülfoksit (DMSO) 100 mcL ICG tozu çözülür. </li><li> Dulbecco&#39;nun Modifiye Eagles Medium (DMEM +% 10 Fötal Buzağı Serumu) medya 400 mcL karışıma ekleyin ve iyice sallayın. Bu sonuç, 2mg/ml son bir konsantrasyon Yeşil İndosiyanin. </li><li> Transfeksiyon ajan Protamin ekleyin. Kontrast madde için bir servis olarak protamin eylemler, bu nedenle daha verimli bir şekilde hücre içine alır. </li><li> 300 mcL ICG ve 300 mcL serum serbest Dulbecco&#39;nun Modifiye Eagles Orta 10mg/ml bir konsantrasyon sağlanır 5 mcL protamin sülfat, karıştırın. </li><li> Formu karmaşık izin vermek için 5 dakika için yeni transfeksiyon çözüm yavaşça sallayın. </li><li> Etiketleme çözümü hazırdır. </li><li> HESC 10mm Petri kabı eski medya aspire. </li><li> Önceden ısıtılmış serum serbest DMEM 5ml ekle. </li><li> Hücreleri için önceden hazırlanmış Protamin / ICG solüsyonu ekleyin. 37 bir kuluçka makinesi, bulaşık koyarak 1 saat inkübasyon Başlat ° C </li><li> Inkübasyon tamamlandıktan sonra, inkübatör çanak kaldırmak ve etiketleme çözümü aspirat. </li><li> 5 ml PBS ile bulaşık durulama hücrelerin yıkayın. </li><li> PBS aspire ve% 0.25 tripsin, 5ml ile değiştirin. 37 ° C&#39;de 5 dakika trypsinization meydana izin çanak inkübe edin. Bu biraz her seferinde bir süre içinde çanak sallamak için yardımcı olur. </li><li> Yavaşça kalan koloniler break up, pipet ve aşağı yukarı. </li><li> KSR bir eşit miktarda çanak ekleyerek tripsin nötralize. </li><li> 15ml tüp hücre çözümü aktarın ve 5 dakika boyunca 400 RCF çözüm santrifüj. </li><li> Tam medya hücrelerin yeniden süspanse edin. </li><li> Hala bu noktada az kümeleri varsa, trypsinize ve tekrar santrifüj. </li><li> Bir tutam ücretsiz cep çözüm elde edildikten sonra, eski medya aspirat ve önceden ısıtılmış tam ESC medya 10ml pelet tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Bu noktada, hESC fare besleyici hücrelerini ayırmak için gereklidir. Bu emin olmak için yapılır, daha sonra, sadece görüntüleme kök hücreler oluşur. </li><li> Bunun için, inci transferijelatin kaplı 10 cm çanak e hücre çözümü. </li><li> Çanak 37 ° C inkübatör içine koyun ve 45 dakika bekletin. Bu süre zarfında, çanak rahatsız emin olun. Şimdi, çanak besleyiciler uyacaktır ve kök hücrelerin olmaz. </li><li> Petri kabı çözüm dışarı aktarın. ve şimdi insan embriyonik kök hücre etiketli bir tek hücre çözümü var. </li><li> Hücreleri sayılabilir ve Tripan mavi test yapılabilir. </li><li> Hücreleri yansıması için hazırız! </li></ol>

<ol><li>Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Metz, S., Piontek, G., Settles, M., Pichler, B., Heinzmann, U., Weinmann, H. J., Schlegel, J., Link, T. M., Rummeny, E. J., Oostendorp, R. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+tracking+with+Gadophrin-2+--+a+bifunctional+contrast+agent+for+MR+imaging%2C+optical+imaging+and+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Nucl+Med+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Stem cell tracking with Gadophrin-2 -- a bifunctional contrast agent for MR imaging, optical imaging and fluorescence microscopy.</a> Eur J Nucl Med Mol Imaging. 31, 1312-1321 (2004).</li>
<li>Simon, G. H., Daldrup-Link, H. E., Kau, J., Metz, S., Schlegel, J., Piontek, G., Saborowski, O., Demos, S., Duyster, J., Pichler, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+experimental+arthritis+using+allogeneic+leukocytes+labeled+with+a+near-infrared+fluorescent+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Nucl+Med+%26+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of experimental arthritis using allogeneic leukocytes labeled with a near-infrared fluorescent probe.</a> Eur J Nucl Med & Mol Imaging. 33, 998-1006 (2006).</li>
<li>Sutton, E., Henning, T., Pichler, B., Bremer, C., Daldrup-Link, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Tracking+with+Optical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Radiol%22%5BJournal%5D)">Cell Tracking with Optical imaging.</a> Eur Radiol. 2, 350-357 (2003).</li>
<li>Funovics, M. A., Alencar, H., Su, H. S., Khazaie, K., Weissleder, R., Mahmood, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+multichannel+near+infrared+endoscope+for+mouse+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Miniaturized multichannel near infrared endoscope for mouse imaging.</a> Mol Imaging. 2, 350-357 (2003).</li>
</ol>

OI floresan algılama göre, görece yeni bir görüntüleme tekniğidir. OI radyotracer tabanlı görüntüleme teknikleri gibi hassas, ancak herhangi bir ışınlama maruz kalma ile ilişkili değildir. OI, böylece hedef site hücre göçü içgörü sağlayan non-invazif ve tekrarlayan izleme hücreleri etkili bir araç sağlar. Tekniğin önemli bir sınırlama in vivo floresan probları sınırlı doku penetrasyonu. Böylece, cilt yüzeyinden 5-10 cm daha derin dokularda bir izleme birikimi, tespit olmayabilir. Mevcut klinik uygulamalar, endoskopik, kardiyovasküler ve ret...

<table><tbody><tr><td>Indosiyanin Yeşili (IR-125)</td><td>Reaktif</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC41254-1000</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-2650</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM Yüksek Glukoz </td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>Jelatin</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td>PBS içinde 0.1% nihai konsantrasyona seyreltin</td></tr><tr><td>PBS, Mg ve Ca içermeyen</td><td>Reaktif</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0.05% </td><td>Reaktif</td><td>Invitrogen</td><td>25300-120</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0.25% </td><td>Reaktif</td><td>Invitrogen</td><td>25200-114</td><td></td></tr><tr><td>FCS, karakterize edilmiş</td><td>Reaktif</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Süzgeci (40 &amp;mu;m Naylon)</td><td>Reaktif</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>DiD</td><td>Reaktif</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>V-22887</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Reaktif</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacer</td><td>Reaktif</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>b-Merkapto&amp;#8211;etanol </td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7522</td><td></td></tr><tr><td>Esansiyel Olmayan Amino Asitler </td><td>Reaktif</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2</td><td>Reaktif</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Glutamin 200mM </td><td>Reaktif</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin/Streptomisin</td><td>Reaktif</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Protamin Sülfat</td><td>Reaktif</td><td>American Pharmaceutical Partners</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

optik görüntüleme ile non-invaziv algılama için floresan boyalar kök hücreler etiketleme

 Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optik görüntüleme (OI), yeni kök hücre tabanlı tedaviler in vivo olarak izlenmesi için kolay, hızlı ve ucuz bir araçtır. Teknik floresan boya etiketli hücreleri belirli hedef organları veya patolojiler kendi birikimi ve görselleştirme sonraki intravenöz enjeksiyon ile kök hücrelerinin ex vivo etiketleme dayanmaktadır. Sunulan tekniği (C67H103CIN2O3S) ve biz insan embriyonik kök hücreleri (hESC) etiket nasıl FDA floresan boya İndosiyanin Yeşil (ICG) onaylı lipofilik floresan boya ile basit inkübasyon insan mezenkimal kök hücreleri (hMSC) etiket nasıl gösterir. Fosfolipid hücre zarı bilayeri genelinde lypophilic boya bağlılık ve difüzyon yoluyla alımı mekanizması. Hücreler serum içeren medya inkübasyon karşı serum serbest medya boya ile inkübe edilir etiketleme verimliliği artırıldı. Ayrıca, transfeksiyon ajan Protamin Sülfat ek kontrast madde alımını önemli ölçüde artırır.

Bu video floresan boya ile insan embriyonik kök hücreler ve mezenkimal kök hücreler etiketleme teknikleri gösterir. Bu teknik, in vivo olarak bir optik görüntüleme ile nakledilen kök hücrelerin izleme ve floresan mikroskobu ile histopatolojik korelasyon kullanılabilir.

Optik Görüntüleme ile non-invaziv Algılama için Floresan Boyalar Kök Hücreler Etiketleme

Optik görüntüleme (OG), yeni kök hücre temelli tedavilerin in vivo izlemi için kolay, hızlı ve düşük maliyetli bir araçtır. Bu teknik, ex vivo...

Dr. Hiku Alge Blink'in laboratuvarına hoş geldiniz. Bu projeyi finanse ettiği için California Rejeneratif Tıp Enstitüsü'ne teşekkür ederiz. Kök hücrelerin floresan kontrast maddesiyle işaretlenmesi, nakledilen kök hücrelerin in vivo takibine olanak tanır.Etiketlenen kök hücrelerin ardından yapılan optik görüntüleme, hücre göçünün in vivo olarak non-invaziv şekilde izlenebildiği boylamsal çalışmalara olanak tanır. Bu video, hem insan embriyonik kök hücrelerini hem de insan mezenkimal kök hücrelerini floresan boyalarla nasıl etiketleyeceğinizi gösterecektir. Merhaba, ben San Francisco'daki California Üniversitesi Radyoloji Bölümü Kontrast Madde Araştırma Grubu'ndan Sophie Boddington.Bugün size, kök hücreleri floresan kontrast maddelerle etiketlemek için kullanılan iki farklı tekniği göstermek istiyorum. Bunlardan biri, mezenkimal kök hücreleri floresan boya DID ile etiketlemek için; diğeri ise insan embriyonik kök hücrelerini endign ingra ile etiketlemek içindir. Öyleyse, insan mezenkimal kök hücrelerini DID ile etiketleme tekniğimizi göstererek başlayayım.Mezenkimal kök hücrelerin etiketlenmesi prosedürüne başlamak için, belirli sayıda hücre içeren bir süspansiyon elde etmek amacıyl

labeling-stem-cells-with-fluorescent-dyes-for-non-invasive-detection

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Değerlendirilmesi için yeni kök hücre tedavileri ile enjekte edilen hücrelerin in vivo takip non-invaziv önemlidir. Bu video demir oksit bazlı kontrast ajanlar ile insan mezenkimal ve embriyonik kök hücreleri, in vivo sonraki MR, in vivo olarak nasıl etiketlemek için size gösterecektir.

Demir Oksit hESC ve hMSCs Etiketleme MR Görüntüleme in vivo Takip Non-Invasive Nanopartiküller

Giderek artan bir ilgi ile kök hücre tedavileri, moleküler görüntüleme teknikleri transplantasyonu sonrası izleme kök hücre davranışı için idealdir. Lusiferaz muhabiri genler hücre sağkalım, konumu ve in vivo çoğalması non-invaziv, tekrarlayan değerlendirme sağladı. Bu video izlemek için yaşayan bir fare hESC çoğalması gösterecektir.

In vitro ve in vivo Biyoparlaklık Reporter Gen Görüntüleme İnsan Embriyonik Kök Hücreleri

Biz, FDA onaylı, süperparamanyetik demir oksit (SPIO), ferumoxytol (Feraheme) ile kök hücre etiketleme ve izleme için kullanılan bir tekniktir açıklar. Hücresel görüntüleme tekniği, manyetik rezonans görüntüleme (MR) görüntüleme için kullanır Bu, başarılı ya da başarısız hastalarda kök hücre engraftments uzun vadeli izleme ve teşhis için kolay erişilebilir.

Kök Hücreler Ferumoxytol, FDA Onaylı Demir Oksit Nanopartikül Etiketleme

Hematopoetik kök hücrelerin işaretleme Kombinatoryel 5 floresan proteinleri rejenerasyon sırasında kemik iliği hematopoetik mimarisi içine anlayışlar, confocal ve iki foton mikroskopi ile in vivo klonal izleme sağlar. Bu yöntem nakli aşağıdaki kapsamlı bir süre için sağlam dokularda spektral kodlu HSPCs kökenli hücrelerin non-invaziv kader haritalama sağlar.

Eşodaklı ve multiphoton Mikroskopi kullanarak beş Floresan Proteinleri ile işaretlenmiş Hematopoetik kök hücrelerin in vivo klonal Takip

Bu makalede, R26R-Confetti fareleri kullanarak çok renkli bir soy izleme deneyi tasarlama ve gerçekleştirme ilkelerini açıklıyoruz. İlgilenilen diğer dokular için modifiye edilebilen kornea epitel hücrelerinin izlenmesi için özel bir protokol sunuyoruz.

Çok renkli Floresan Reporter Fare kullanma Kornea Hücre Lineage İzleme Bir Yöntem

Hücre nakli, hücre iskeleti etiketleme ve fonksiyon kaybı/kazanımı yaklaşımlarını birleştiren bu protokol, göç eden zebra balığı prospektif prekordal plağın, in vivo hücre göçünde bir aday genin işlevini analiz etmek için nasıl kullanılabileceğini açıklar.

Analiz<em&gt; İn Vivo</em&gt; Hücre Göç Zebra balığı Embriyolar hücre nakli ve Time-lapse Görüntüleme kullanılarak

Bu iletişim kuralı tarafından far-red floresan intra artiküler (IA) enjeksiyon yoluyla bir sıçan diz osteoartrit (KOA) modelinde etiketleme hücre sebat ve biodistribution insan yağ elde edilen Mezenkimal kök hücrelerin (haMSCs) izlemek için etkili bir yöntem açıklanır.

Vivo İnsan yağ elde edilen Mezenkimal kök hücrelerin sıçan diz osteoartrit modelinde floresan lipofilik membran boya ile izleme

İnsan primer prostat epitel hücreleri kullanarak, kök benzeri hücrelerin küresel tabanlı etiket tutma testi ile fonksiyonel karakterizasyonu için yeni bir biyomarker-free yöntemi ni rapor ediyoruz. BrdU, CFSE veya Far Red 2D hücre etiketlemesi için adım adım bir protokol tanımlanır; üç boyutlu küresel oluşum; immünositokimya ile etiket tutucu kök benzeri hücre tanımlama; ve FACS tarafından izolasyon.

3 Boyutlu Spheroid Kültürlerden Kök Benzeri Hücrelerin İzolasyon

Bu protokol, i) konfokal bir mikroskop, ii) yoğunluk görüntülemesi yapmak için bir floresan aktive hücre sıralayıcısı veya iii) floresan ömür boyu görüntüleme gerçekleştirmek için bir çoklu foton mikroskobu kullanarak otofloresan görüntüleme yoluyla birincil yetişkin fare nöral kök hücre kültürlerinde hücre durumunu tanımlama ve zenginleştirme stratejilerini açıklar.

Nöral Kök Hücre Aktivasyon Durumunun İn Vitro Otofloresan Kullanılarak Sınıflandırılması

Burada tarif edilen intravital görüntüleme yöntemi, 4D intravital görüntülerin derinlemesine analizi için etiketlenmemiş bir tümör mikroçevresini tümör, stromal ve vasküler kompartmanlara invaziv olmayan bir şekilde segmentlere ayırmak için metabolik ko-faktör NAD (P) H'den kollajen ikinci harmonik jenerasyonu ve endojen floresanı kullanır.

Meme Tümörü Mikroçevresinin İntravital Görüntülemesi için Etiketsiz Bir Segmentasyon Yaklaşımı

Fare kesicisi, kök hücre nişinde değerli etiket tutucu hücreler içerir. Etiket tutucu hücreleri tarafsız bir şekilde tespit etmek ve ölçmek için yeni bir yolumuz var; Çalışmamızda EdU etiketleme ve PEGASOS dokusunun mandibuladan temizlenmesinden sonra 3D rekonstrüksiyon yaklaşımı kullanılmıştır.

Doku Temizliğinden Sonra 3D Rekonstrüksiyon Yaklaşımı Kullanılarak Fare Kesici Dişlerinde Etiket Tutan Hücrelerin Tespiti ve Kantitasyonu

Öğrenin, insan embriyonik kök hücreleri ve mezenkimal kök hücreleri floresan boyalarla etiketleme yöntemini. Optik görüntüleme ile non-invaziv izleme sağlar ve rejeneratif tıpta hücre davranışlarını anlamaya yardımcı olur.

Optik Görüntüleme ile non-invaziv Algılama için Floresan Boyalar Kök Hücreler Etiketleme

Daha fazla video keşfet