Amplificazione e riconoscimento dei microRNA attraverso l'ibridazione in situ dell'acido nucleico bloccato come nuovo metodo di rilevamento e quantificazione

L'ambito della nostra ricerca era sviluppare e convalidare un saggio che rilevasse e quantificasse simultaneamente microRNA e molteplici proteine all'interno del tessuto FFPE, per osservare al meglio la relazione tra i due all'interno del TME. Supera in realtà le limitazioni comuni del sequenziamento molecolare esistente e del tradizionale forniendo una quantificazione diretta, la localizzazione e la rilevazione simultanea spaziale di microRNA e proteine, il tutto senza distruggere il tessuto e preservare la localizzazione cellulare e subcellulare. Questa tecnologia potenzialmente apre la strada sia alla ricerca di base sulle reti regolatorie, ai meccanismi delle malattie, sia a studi traslazionali o clinici alla ricerca di biomarcatori e bersagli terapeutici migliori.

Inizia prelevando campioni di paraffina fissati con formalina di tumore ovarico umano, conservati durante la notte a 60 gradi Celsius. Utilizzando acqua priva di RNAse, pulire accuratamente tutte le attrezzature e gli strumenti. Successivamente, per eseguire la deparaffinizzazione, immergi i campioni nello xilene tre volte per cinque minuti ciascuno.

Reidratare i tessuti con 10 cicli di etanolo diluito in sequenza, ciascuno per tre minuti. Poi, lava i campioni una volta in TBS per due minuti. Applicare una soluzione di perossido di idrogeno al 3% sui campioni per 10 minuti.

Lava i campioni due volte per due minuti ciascuno con TBS. Poi, applica una soluzione di paraformaldeide al 3,7% per 10 minuti. Dopodiché, inizia il primo ciclo di prelievo di antigeni utilizzando il sistema a infrarossi easy retriever.

Immergi i vetri in un tampone EZ-AR 1 fresco e riscalda il microonde a 95 gradi Celsius per 15 minuti. Poi risciacquare i campioni in TBS per due minuti, seguiti da due lavaggi da due minuti in TBST. Per cominciare, traccia una barriera attorno a ogni sezione di tessuto usando una penna barriera idrofobica.

Aggiungi la soluzione anticorpale bloccante e incuba i vetrini per 30 minuti a temperatura ambiente in una camera di umidità. Ora, applica l'anticorpo primario diluito nella stessa soluzione bloccante per coprire completamente la sezione tissutale e incuba per un'ora a temperatura ambiente in una camera di umidità. Dopo aver lavato i vetrini tre volte in TBST, aggiungere la soluzione anti-topo e la perossidasi di rafano del coniglio per coprire il tessuto e incubare nella camera di umidità a temperatura ambiente per 10 minuti.

Ora, diluisci il primo fluoro-4 con un rapporto 1:100 con diluente di amplificazione. Applica questa miscela sul tessuto e incuba per 10 minuti a temperatura ambiente in una camera di umidità, evitando l'esposizione diretta alla luce. Dopo aver eseguito il secondo ciclo di prelievo e blocco dell'antigene come mostrato in precedenza, diluire il secondo anticorpo primario con la stessa soluzione bloccante.

Applicare l'anticorpo diluito per coprire l'intera sezione tissutale e incubare durante la notte per almeno 16 ore a quattro gradi Celsius all'interno di una camera di umidità. Il giorno successivo, lavare le vetrine tre volte per due minuti ciascuna in TBST e incubare con soluzione anti-topo e perossidasi di rafano coniglio come mostrato in precedenza. Successivamente, applicare il secondo fluoro-4 diluito alle vetri e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente nella camera di umidità.

Per l'applicazione della sonda, lavare i vetri tre volte per due minuti ciascuno in TBST. Per iniziare il terzo e ultimo prelievo dell'antigene, immergi i vetrini in EZ-AR 1 Elegance buffer e riscalda il microonde a 107 gradi Celsius per 15 minuti. Raffredda le vetrine a temperatura ambiente per 20 minuti prima di lavarle una volta per tre minuti a cucchiere.

Applicare abbastanza RNAscope Proteasi Plus per coprire l'area tissutale e incubare a 40 gradi Celsius per 30 minuti usando un forno. Poi, riscalda la sonda di acido nucleico bloccata a microRNA a 90 gradi Celsius per quattro minuti per denaturarla. Diluire immediatamente la sonda denaturata con un buffer di ibridazione in situ a microRNA.

Dopo aver fatto vorticare e ruotare la sonda preparata, aggiungila per coprire tutta l'area del tessuto e incubare per un'ora a 60 gradi Celsius in forno. Lava i vetri una volta per cinque minuti in 5x SSC Buffer. Esegui cinque lavaggi rigorosi a 60 gradi Celsius usando SSC Buffer per cinque minuti ciascuno.

Poi, lava le vetri una volta per cinque minuti con 0,2 volte SSC a temperatura ambiente. Per preparare il tampone bloccante, si combinano TBS e polvere di reagente bloccante allo 0,5%. Applica il tampone bloccante e incuba per 30 minuti a temperatura ambiente in una camera umidificata.

Successivamente, applica anti-digossina e coniugato di peroxidasi di rafano topino, e incuba per 30 minuti a temperatura ambiente in una camera umidificata. Dopo tre lavaggi TBST, applicare diluizione 1:50 dell'amplificazione del segnale tiramidico più ciarina 3 sulle vetrine per 10 minuti a temperatura ambiente in una camera di umidità. Lava le vetrine altre tre volte per cinque minuti ciascuna in TBST.

Applica abbastanza soluzione di lavoro DAPI diluita 1:1000 in TBS per coprire completamente la sezione di tessuto. Incubare i vetrini per cinque minuti a temperatura ambiente in una camera umidificata con umidità ambientale. Lava i vetrini tre volte per cinque minuti ciascuno in TBST.

Applica le coperture con un supporto di montaggio e lascia asciugare le vetrioni per 10 minuti a temperatura ambiente. Conservare i vetrini essiccati a quattro gradi Celsius al buio per 24-72 ore prima dell'imaging o fino a tre mesi per conservazione a lungo termine. L'espressione del miRNA di miR-181c-3p è stata rilevata costantemente sia in vetri di controllo che in quelli colorati con anticorpi, con segnali visibilmente più forti concentrati nelle aree cellulari tumorali.

L'applicazione dell'anticorpo anti-EpCAM con un fluoroforo a emissione di 620 nanometri ha colorato le cellule tumorali nel campione di HGSC. Applicazione dell'anticorpo anti-CD8 con fluorofori a emissione di 620 nanometri distintamente marcati come cellula T CD8 positiva. La rilevazione combinata di proteine e miRNA ha permesso la localizzazione spaziale di miR-181c-3p rispetto alle cellule tumorali positive a EpCAM e alle cellule immunitarie CD8 positive.

La sonda di controllo positivo, che ha preso di mira il piccolo RNA nucleare U6, ha prodotto forti segnali fluorescenti su tutti i tipi di tessuti, confermando l'efficacia della sonda e l'integrità del tessuto. La sonda di controllo negativa, che utilizzava una sequenza di miRNA mescolata, non ha mostrato alcun segnale rilevabile in nessun tipo di tessuto, indicando nessun legame aspecifico. La sonda bersaglio per miR-181c-3p ha mostrato una forte espressione nel tessuto carcinoma sieroso di alto grado senza alcun segnale nel tessuto ovarico normale o nel tessuto normale della tuba di Falloppio, dimostrando la specificità e l'accuratezza della sonda e del saggio.