Name: Amplificazione e riconoscimento dei microRNA attraverso libridazione in situ dellacido nucleico bloccato come nuovo metodo di rilevamento e quantificazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Scopri un metodo di ibridazione in tandem per rilevare e quantificare microRNA e proteine in tessuto FFPE. Questa tecnica preserva l'integrità tissutale e permette l'osservazione spaziale delle interazioni molecolari nel microambiente tumorale.

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<ol><li>Smolarz, B., Nowak, A. Z., Romanowicz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer-epidemiology%2C+classification%2C+pathogenesis+and+treatment+%28review+of+literature%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Breast cancer-epidemiology, classification, pathogenesis and treatment (review of literature).</a> Cancers. 14 (10), 2569(2022).</li>
<li>Davis-Dusenbery, B. N., Hata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microrna+in+cancer%3A+The+involvement+of+aberrant+microrna+biogenesis+regulatory+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cancer%22%5BJournal%5D)">Microrna in cancer: The involvement of aberrant microrna biogenesis regulatory pathways.</a> Genes Cancer. 1 (11), 1100-1114 (2010).</li>
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<li>Juźwik, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+dysregulation+in+neurodegenerative+diseases%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA dysregulation in neurodegenerative diseases: A systematic review.</a> Prog Neurobiol. 182, 101664(2019).</li>
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<li>Lin, B., Jiang, J., Jia, J., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+exosomal+miRNA+biosensing+for+liquid+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Recent advances in exosomal miRNA biosensing for liquid biopsy.</a> Molecules. 27 (21), 7145(2022).</li>
<li>Farrell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+identification+of+circulating+miRNAs+in+bovine+serum+and+their+potential+as+novel+biomarkers+of+early+Mycobacterium+avium+subsp.+paratuberculosis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The identification of circulating miRNAs in bovine serum and their potential as novel biomarkers of early Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis infection.</a> PLoS One. 10 (7), e0134310(2015).</li>
<li>Aparicio-Puerta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Srnabench+and+srnatoolbox+2022+update%3A+Accurate+mirna+and+sncrna+profiling+for+model+and+non-model+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Srnabench and srnatoolbox 2022 update: Accurate mirna and sncrna profiling for model and non-model organisms.</a> Nuc Acid Res. 50 (W1), W710-W717 (2022).</li>
<li>Friedländer, M. R., Mackowiak, S. D., Li, N., Chen, W., Rajewsky, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mirdeep2+accurately+identifies+known+and+hundreds+of+novel+microRNA+genes+in+seven+animal+clades%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Mirdeep2 accurately identifies known and hundreds of novel microRNA genes in seven animal clades.</a> Nuc Acid Res. 40 (1), 37-52 (2012).</li>
<li>Chou, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mirtarbase+2016%3A+Updates+to+the+experimentally+validated+miRNA-target+interactions+database%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Mirtarbase 2016: Updates to the experimentally validated miRNA-target interactions database.</a> Nuc Acid Res. 44 (D1), D239-D247 (2016).</li>
<li>Porichis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+detection+of+miRNAs+and+gene-specific+mRNA+at+the+single-cell+level+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">High-throughput detection of miRNAs and gene-specific mRNA at the single-cell level by flow cytometry.</a> Nat Commun. 5 (1), 5641(2014).</li>
<li>Eichert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structure+of+an+%27all+locked%27+nucleic+acid+duplex%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">The crystal structure of an 'all locked' nucleic acid duplex.</a> Nuc Acid Res. 38 (19), 6729-6736 (2010).</li>
<li>Viratham Pulsawatdi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+multiplex+immunofluorescence+and+digital+pathology+workflow+for+the+characterisation+of+the+tumour+immune+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">A robust multiplex immunofluorescence and digital pathology workflow for the characterisation of the tumour immune microenvironment.</a> Mol Oncol. 14 (10), 2384-2402 (2020).</li>
<li>Janati-Idrissi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+for+a+needle+in+a+haystack%3A+De+novo+phenotypic+target+identification+reveals+hippo+pathway-mediated+mir-202+regulation+of+egg+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Looking for a needle in a haystack: De novo phenotypic target identification reveals hippo pathway-mediated mir-202 regulation of egg production.</a> Nuc Acid Res. 52 (2), 738-754 (2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>10x soluzione salina tamponata TRIS (TBS) pH 7,6&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; J62662&nbsp; K7</td><td>Per lavaggi intermittenti tra una fase e l'altra</td></tr><tr><td>1x Diluente/Blocco/Blocco di Anticorpi Opalo;</td><td>Akoya Biosciences</td><td>ARD1001EA</td><td>Soluzione bloccante delle proteine</td></tr><tr><td>Diluente di amplificazione 1x Plus Automation</td><td>Akoya Bioscienze&nbsp;</td><td>FP1609</td><td>Usata per diluire i fluorofori opali</td></tr><tr><td>20x Concentrate&nbsp; Tampone di citrato di sodio salino (SSC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6639-1L</td><td>Per lavaggi di miRNA dopo l'ibridazione con sonda</td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific/Invitrogen</td><td>EN62248 / 62248</td><td>Per la colorazione nucleare</td></tr><tr><td>Sistema di ibridazione ACD HybEZ II</td><td>ACD Biotechne</td><td>321711</td><td>Forno usato per regolare la temperatura durante il protocollo miRNAscope</td></tr><tr><td>Anti-CD8 (D8A8Y), mAb coniglio</td><td>Tecnologie di segnalazione cellulare</td><td>85336S</td><td>Esempio di anticorpo primario utilizzato per ottimizzare questo protocollo</td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenina (Topo) HRP Coniugato</td><td>Revvity Health Sciences Inc</td><td>NEF832001EA</td><td>Reagente secondario utilizzato per il rilevamento dei miRNA</td></tr><tr><td>Anti-EpCAM (E6V8Y), Rabbit mAb</td><td>Tecnologie di segnalazione cellulare</td><td>93790</td><td>Esempio di anticorpo primario utilizzato per ottimizzare questo protocollo</td></tr><tr><td>Blocco della polvere di reagente</td><td>Akoya Bioscienze&nbsp;</td><td>FP1012</td><td>Soluzione bloccante del miRNA</td></tr><tr><td>Alcol etilico 100% (200 proof)</td><td>Pharmco</td><td>111000200</td><td>Per la deparaffinizzazione</td></tr><tr><td>EZ-AR1 Buffer</td><td>BioGeneX</td><td>HK521-XAK</td><td>Utilizzato per il prelievo di antigeni di sezioni di tessuto FFPE nella fase proteica</td></tr><tr><td>EZ-AR1 Elegance Buffer</td><td>BioGeneX</td><td>HK546-XAK</td><td>Utilizzato per il prelievo di antigeni di sezioni di tessuto FFPE nella fase di sonda del miRNA</td></tr><tr><td>Sistema IR EZ-Retriever</td><td>BioGeneX</td><td>MW015-IR</td><td>Microonde utilizzato per il prelievo di antigeni di sezioni di tessuto FFPE</td></tr><tr><td>Soluzione di perossido di idrogeno 30%&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>HX0640-5&nbsp;</td><td>Per la preparazione dei fazzoletti. Aiuta a bloccare l'attività endogena della perossidasi e a produrre prodotti molto colorati</td></tr><tr><td>Sonda miRNA miR-181c-3p</td><td>Qiagen</td><td>339112</td><td>Esempio di sonda miRNA utilizzata per ottimizzare questo protocollo</td></tr><tr><td>MiRCURY LNA miRNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE)</td><td>Qiagen</td><td>339450&nbsp;</td><td>Usata per diluire la sonda del miRNA</td></tr><tr><td>Opal 620</td><td>Akoya Bioscienze&nbsp;</td><td>FP1495001KT</td><td>Fluoroferano per identificare l'anticorpo primario</td></tr><tr><td>Opal 690&nbsp;</td><td>Akoya Bioscienze&nbsp;</td><td>FP1497001KT</td><td>Fluoroferano per identificare l'anticorpo primario</td></tr><tr><td>Opal Anti-Ms + Rb HRP</td><td>Akoya Biosciences</td><td>ARH1001EA</td><td>Anticorpo secondario utilizzato come agente di rilevamento</td></tr><tr><td>Pierce 16% Formaldeide (w/v), Privo di metanolo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td>Produrre il 3,7% di PFA per la preparazione dei tessuti</td></tr><tr><td>Antifade a diamante ProLong</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36970</td><td>Supporti di montaggio</td></tr><tr><td>RNAscope Proteasi Plus</td><td>ACD Biotechne</td><td>322331</td><td>Per permeabilizzare le sezioni tissutali &nbsp; digerendo parzialmente proteine e esporre le molecole di miRNA target</td></tr><tr><td>Acqua priva di RNAsi &nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>46-000-CM&nbsp;</td><td>Pulire e preparare tutta l'attrezzatura, e usarli come diluito quando necessario&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Preadolescenti 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379-25ML</td><td>Per realizzare TBS-T</td></tr><tr><td>Amplificazione del segnale con tiramide più cianina 3</td><td>Akoya Bioscienze&nbsp;</td><td>NEL744001KT</td><td>Fluoroferano per identificare i miRNA</td></tr><tr><td>Sonde miRNA U6 e Scramble</td><td>Qiagen</td><td>339459</td><td>Sonde di controllo opzionali</td></tr><tr><td>Grado istologico degli xileni</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>UN1307</td><td>Per la deparaffinizzazione</td></tr></tbody></table>

amplificazione e riconoscimento dei microrna attraverso l'ibridazione in situ dell'acido nucleico bloccato come nuovo metodo di rilevamento e quantificazione

MicroRNA Amplification and Recognition through Locked-nucleic-acid In situ Hybridization as a Novel Detection and Quantification Method

Amplificazione e riconoscimento dei microRNA attraverso l'ibridazione in situ dell'acido nucleico bloccato come nuovo metodo di rilevamento e quantificazione

When using traditional probe-based in situ hybridization (ISH) imaging detection methods, microRNAs (miRNAs) are difficult to capture due to their size, ...

microrna-amplification-recognition-through-locked-nucleic-acid-situ

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Qui descrivere un ottimizzato trascrittasi inversa multiplex PCR quantitativa (QRT-PCR) protocollo in combinazione con una piattaforma microfluidica come un efficace costi e tempi high-throughput screening per microRNA (miRNA) livelli di espressione, soprattutto quando si lavora con quantità limitate di campione.

Alta MicroRNA profiling Throughput: Multiplex Ottimizzato qRT-PCR a scala nanoliter sul Fluidigm dinamica IFCS ArrayTM

Un romanzo ad alta produttività metodo è descritto che consente il rilevamento e la quantificazione relativa di RNA di piccole e di espressione di mRNA da singole cellule batteriche con bloccate le sonde di acidi nucleici e di citometria a flusso...

Chiuso flusso degli acidi nucleici Citometria fluorescenza In situ Ibridazione (LNA flow-FISH): un metodo per la rilevazione dei batteri piccoli RNA

Questo video descrive una strategia di ibridazione sequenziale che prevede l'ibridazione di sonde di mRNA su mRNA target specifici. Dopo l'ibridazione della sonda, viene eseguita l'amplificazione del segnale per migliorare la risoluzione attraverso la riduzione del rapporto segnale/rumore durante l'RNA-CISH dei campioni istologici.

Ibridazione con sonda e amplificazione del segnale nell'ibridazione in situ dell'RNA: una tecnica per rilevare specifiche sequenze di RNA in sezioni di tessuto

Lo scopo di questa pubblicazione è quello di visualizzare e discutere le fasi operative di un protocollo Northern Blot avanzata su RNA estratto da Drosophila melanogaster embrioni, cellule e tessuti. Questo protocollo è particolarmente utile per il rilevamento efficiente delle piccole specie di RNA.

Maggiore Northern Blot rilevazione di piccoli RNA specie in Drosophila melanogaster

I microRNA (miRNA) sono una classe ampiamente conservata di molecole regolatorie. Qui descriviamo un metodo di clonazione dei miRNA che si basa su due potenti fasi di legatura seguite da un sequenziamento ad alto rendimento. Il nostro metodo consente un'accurata quantificazione dell'intero genoma dei miRNA.

Legatura altamente efficiente delle piccole molecole di RNA per microRNA Quantificazione mediante sequenziamento High-Throughput

MicroRNA circolanti sono recentemente emersi come biomarcatori promettenti e innovativi per vari tipi di cancro e di altre malattie. L'obiettivo di questo articolo è quello di discutere di tre diverse piattaforme di PCR real-time sonda-based e metodi che sono disponibili per quantificare e determinare l'abbondanza dei microRNA circolanti.

Base-Probe Real-time PCR Approcci per la misurazione quantitativa dei microRNA

Qui presentiamo un protocollo per rilevare l'espressione di miRNA in campioni di pazienti con cancro al seno utilizzando l'ibridazione in situ di miRNA.

Analisi clinicopatologica di miRNA espressione in Breast Cancer tessuti mediante l&#39;utilizzo di miRNA<em&gt; In Situ</em&gt; ibridazione

Questo rapporto descrive un metodo veloce e affidabile per la convalida di mRNA bersaglio di Mirna cellulari. Il metodo utilizza biotinilati sintetici basati su Locked Nucleic Acid LNA miRNA imita per catturare destinazione mRNA. Successivamente, biglie magnetiche rivestite con streptavidina sono impiegati per pulldown il bersaglio mRNA per quantificazione da reazione a catena della polimerasi qPCR.

Biotina-based Pulldown Assay Validate mRNA Mirna obiettivi del cellulare

Per riproducibile contare i numeri dei mRNAs in singoli ovociti, in situ di fluorescenza di singola molecola del RNA (RNA-pesce) l'ibridazione è stato ottimizzato per cellule non aderenti. Gli ovociti sono stati raccolti, ibridata con le sonde specifiche di trascrizione e quantificati tramite un software di quantificazione di immagine.

Uso di singola molecola fluorescente ibridazione In Situ (SM-pesce) per quantificare e Localize mRNAs in ovociti murini

Questo metodo dimostra l'uso della tecnica di ibridazione settentrionale per rilevare i miRNA dall'estratto totale di RNA.

RNA Blot Analisi per il rilevamento e la quantificazione dei microRNA vegetali

Le nanomacchine basate su DNAzyme possono essere utilizzate per il rilevamento altamente selettivo e sensibile degli acidi nucleici. Questo articolo descrive un protocollo dettagliato per la progettazione di nanomacchine basate su DNAzyme con un nucleo 10-23 utilizzando software libero e la loro applicazione nel rilevamento di un frammento di virus di Epstein-Barr come esempio.

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Scopri un metodo di ibridazione in tandem per rilevare e quantificare microRNA e proteine in tessuto FFPE. Questa tecnica preserva l'integrità tissutale e permette l'osservazione spaziale delle interazioni molecolari nel microambiente tumorale.

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