Risoluzione subnanometrica Determinazione strutturale dell'emoagglutinina dalla tomografia crioelettronica dei virus influenzali

Il nostro laboratorio utilizza la biologia strutturale per studiare i virus e l'evoluzione della resistenza ai farmaci. Nel lavoro attuale, stiamo caratterizzando come l'emoglutinina influenzale modifichi la conformazione al momento del legame dei recettori. Abbiamo sfruttato la criotomografia elettronica per visualizzare l'organizzazione e la struttura della morfologia virale.

In particolare, abbiamo utilizzato questa modalità di criomicroscopia elettronica per ottenere immagini dell'influenza virale pleomorfa. Il nostro protocollo ci permette di studiare l'organizzazione e la struttura dell'emoglutinina influenzale in situ su virus intatti a risoluzione sub-nanometrica. Questa risoluzione più alta ci permette di visualizzare interazioni precedentemente nascoste.

Per cominciare, avvia un terminale Linux per attivare l'ambiente Conda. Usa il terminale per attivare l'ambiente Conda con la rete ISO installata. Crea una sottocartella chiamata tomo folder, poi sposta tutti i file tomogram in quella cartella.

Successivamente, usa il codice per generare un file stella nella cartella del progetto. Utilizzando un editor di testo, apri il file a stella generato e inserisci il valore approssimativo di defocus per le immagini a inclinazione zero gradi nella quarta colonna. Ora esegui il comando convoluzione CTFD nel terminale.

Dopo aver deconvoluto, attiva l'ambiente GUI EMAN2 per iniziare la pre-elaborazione della selezione delle particelle. Sotto tomografia, clicca con il tasto sinistro sulla freccia accanto a dati grezzi, seleziona importa tomogrammi dal menu a tendina e scegli i file. Poi, clicca con il tasto sinistro sulla freccia accanto a segmentazione e scegli tomogrammi pre-elaborati.

Usa parametri predefiniti adeguati. Dopo la pre-elaborazione, verrà creata automaticamente una directory informativa con file JSON vuoti che corrispondono ai nomi base dei file tomografici di processo. Aggiungi informazioni sui pixel di Angstrom ai file prima di procedere.

Per addestrare una rete neurale convoluzionale, o CNN, a riconoscere la glicoproteina HA, si modifica la directory di lavoro in base alla posizione dei tomogrammi da utilizzare. Poi apri l'interfaccia di addestramento CNN usando il terminale. Conferma che quattro finestre siano aperte.

Una contiene le informazioni sui parametri CNN e sui tomogramss nella directory, e le altre tre finestre contengono immagini di buoni riferimenti, cattive riferimenti e particelle selezionate dalla CNN. Nella GUI CNN, clicca sulla nuova opzione per inizializzare una CNN con tasso di apprendimento predefinito di 0,0001 e dimensione di scatola di otto. Sotto la colonna nome del file, clicca con il sinistro su un tomogramma rappresentativo per aprirlo.

Passa il cursore sopra il tomogramma aperto e clicca sulla rotella del mouse per aprire una nuova finestra. Clicca con il tasso sinistro sul cursore N per attraversare l'asse Z. Successivamente, nel tomogramma aperto, usa il pannello di buone riferimenti per selezionare da 10 a 20 caratteristiche corrispondenti all'HA. Immagini positive appaiono nella finestra positiva.

Per rimuoverne uno, tieni premuto shift e clicca con il clic sinistro. Ora passa al pannello riferimenti difettosi e seleziona da 10 a 20 riferimenti corrispondenti a caratteristiche come patch di membrana vuote, densità RNP, marcatori fiduciali e detriti. Imposta il numero di iterazioni a 50 e clicca sull'icona del treno per iniziare l'addestramento CNN.

Dopo aver completato la formazione, premi applica. Le particelle selezionate saranno visualizzate sul tomogramma come cerchi blu o possono essere viste nella finestra delle particelle. Continua a perfezionare selezionando ulteriori riferimenti positivi e negativi, cliccando periodicamente su salvata per preservare i progressi.

Una volta che la CNN funziona soddisfacentemente, clicca su applica tutto per eseguire la selezione delle particelle. Poi valuta i risultati di diversi tomogrammi e riallena secondo necessità. Per salvare le coordinate per ogni tomogramma, riapri l'interfaccia grafica di EMAN2 usando il comando e2projectmanager.py.

Clicca sulla freccia sotto la media del subtomogramma e seleziona pugilato manuale. Ora, inserisci il nome del tomogramma e clicca su launch. Poi, clicca sequencialmente su file, salva il filo della casella e tomogram_ha.

Sappt per salvare le coordinate. Naviga nella sottocartella della rete neurale e nelle sottocartelle delle informazioni per fare il backup e il salvataggio tramite rete. HDF, uscite di treni.

HDF, segout. hdf, e boxes3Dref.hdf. Addestrare una seconda CNN per rilevare lo strato proteico M1 e la presenza di VRNP modificando la dimensione della scatola di addestramento da otto a quattordici.

Per curare le particelle, prima scarica i quaderni dal repository GitHub. Poi apri il notebook IPYNB che pulisce le particelle CNN e carica i moduli richiesti. Carica i file di testo delle coordinate HA e M1 nel notebook.

Visualizzali come nuvole 3D usando la libreria 3D aperta. Successivamente, filtrare i valori anomali delle coordinate HA utilizzando il metodo aperto di rimozione degli outlier statistici 3D. Successivamente, calcola le distanze tra le nuvole di punti HA e M1 identificando i punti HA a più di 20 pixel da M1 come valori anomali e salva le coordinate rimanenti in un file di testo in uscita.

Concatena tutte le particelle e salva come file star usando il file star pts2. IPYNB. Usando WarpTools, estrai le particelle che piegano il fattore di quattro ed esegui la media iniziale del subtomogramma in RELION meno quattro usando il codice. Converti il file a stella di teletrasporto in formato RELION quattro.

Successivamente genera un riferimento iniziale usando RELION refine MPI su un sottoinsieme di particelle. Esegui il raffinamento automatico 3D sui subtomogrammi con RELION Refine MPI. Alla convergenza, ripeti il raffinamento automatico con offset di traslazione del titano a otto e passo a due.

Sfrutta la classificazione 2D per scartare particelle di spazzatura usando la raffinazione RELION. Crea file stella con buone classi usando il codice, poi combina i singoli file stella. Tomogrammi rappresentativi hanno rivelato virioni pleomorfi con forme che variavano da sferiche a allungate.

La media finale del subtomogramma ha raggiunto una risoluzione globale di 6,0 angstrom con una risoluzione locale che varia da cinque a sette angstrom. Eliche alfa e fogli beta sono state risolte nella ricostruzione finale dell'HA, supportando la qualità strutturale della mappa raffinata. I siti di glicosilazione sono stati identificabili in quattro posizioni sulla testa e sul fusto dell'AH, confermando la visibilità della densità glicanica nella ricostruzione finale.