Risoluzione subnanometrica Determinazione strutturale dell'emoagglutinina dalla tomografia crioelettronica dei virus influenzali
November 7th, 2025
Questo articolo presenta un protocollo per l'elaborazione dei dati dei virus influenzali sottoposti a imaging utilizzando la tomografia crioelettronica e il successivo subtomogramma che calcola la media della glicoproteina emoagglutinina. Questo protocollo copre l'elaborazione dei dati passo dopo passo, dalla pre-elaborazione delle immagini al perfezionamento del modello finale.
Il nostro laboratorio utilizza la biologia strutturale per studiare i virus e l'evoluzione della resistenza ai farmaci. Nel lavoro attuale, stiamo caratterizzando come l'emoglutinina influenzale modifichi la conformazione al momento del legame dei recettori. Abbiamo sfruttato la criotomografia elettronica per visualizzare l'organizzazione e la struttura della morfologia virale.
In particolare, abbiamo utilizzato questa modalità di criomicroscopia elettronica per ottenere immagini dell'influenza virale pleomorfa. Il nostro protocollo ci permette di studiare l'organizzazione e la struttura dell'emoglutinina influenzale in situ su virus intatti a risoluzione sub-nanometrica. Questa risoluzione più alta ci permette di visualizzare interazioni precedentemente nascoste.
Per cominciare, avvia un terminale Linux per attivare l'ambiente Conda. Usa il terminale per attivare l'ambiente Conda con la rete ISO installata. Crea una sottocartella chiamata tomo folder, poi sposta tutti i file tomogram in quella cartella.
Successivamente, usa il codice per generare un file stella nella cartella del progetto. Utilizzando un editor di testo, apri il file a stella generato e inserisci il valore approssimativo di defocus per le immagini a inclinazione zero gradi nella quarta colonna. Ora esegui il comando convoluzione CTFD nel terminale.
Dopo aver deconvoluto, attiva l'ambiente GUI EMAN2 per iniziare la pre-elaborazione della selezione delle particelle. Sotto tomografia, clicca con il tasto sinistro sulla freccia accanto a dati grezzi, seleziona importa tomogrammi dal menu a tendina e scegli i file. Poi, clicca con il tasto sinistro sulla freccia accanto a segmentazione e scegli tomogrammi pre-elaborati.
Usa parametri predefiniti adeguati. Dopo la pre-elaborazione, verrà creata automaticamente una directory informativa con file JSON vuoti che corrispondono ai nomi base dei file tomografici di processo. Aggiungi informazioni sui pixel di Angstrom ai file prima di procedere.
Per addestrare una rete neurale convoluzionale, o CNN, a riconoscere la glicoproteina HA, si modifica la directory di lavoro in base alla posizione dei tomogrammi da utilizzare. Poi apri l'interfaccia di addestramento CNN usando il terminale. Conferma che quattro finestre siano aperte.
Una contiene le informazioni sui parametri CNN e sui tomogramss nella directory, e le altre tre finestre contengono immagini di buoni riferimenti, cattive riferimenti e particelle selezionate dalla CNN. Nella GUI CNN, clicca sulla nuova opzione per inizializzare una CNN con tasso di apprendimento predefinito di 0,0001 e dimensione di scatola di otto. Sotto la colonna nome del file, clicca con il sinistro su un tomogramma rappresentativo per aprirlo.
Passa il cursore sopra il tomogramma aperto e clicca sulla rotella del mouse per aprire una nuova finestra. Clicca con il tasso sinistro sul cursore N per attraversare l'asse Z. Successivamente, nel tomogramma aperto, usa il pannello di buone riferimenti per selezionare da 10 a 20 caratteristiche corrispondenti all'HA. Immagini positive appaiono nella finestra positiva.
Per rimuoverne uno, tieni premuto shift e clicca con il clic sinistro. Ora passa al pannello riferimenti difettosi e seleziona da 10 a 20 riferimenti corrispondenti a caratteristiche come patch di membrana vuote, densità RNP, marcatori fiduciali e detriti. Imposta il numero di iterazioni a 50 e clicca sull'icona del treno per iniziare l'addestramento CNN.
Dopo aver completato la formazione, premi applica. Le particelle selezionate saranno visualizzate sul tomogramma come cerchi blu o possono essere viste nella finestra delle particelle. Continua a perfezionare selezionando ulteriori riferimenti positivi e negativi, cliccando periodicamente su salvata per preservare i progressi.
Una volta che la CNN funziona soddisfacentemente, clicca su applica tutto per eseguire la selezione delle particelle. Poi valuta i risultati di diversi tomogrammi e riallena secondo necessità. Per salvare le coordinate per ogni tomogramma, riapri l'interfaccia grafica di EMAN2 usando il comando e2projectmanager.py.
Clicca sulla freccia sotto la media del subtomogramma e seleziona pugilato manuale. Ora, inserisci il nome del tomogramma e clicca su launch. Poi, clicca sequencialmente su file, salva il filo della casella e tomogram_ha.
Sappt per salvare le coordinate. Naviga nella sottocartella della rete neurale e nelle sottocartelle delle informazioni per fare il backup e il salvataggio tramite rete. HDF, uscite di treni.
HDF, segout. hdf, e boxes3Dref.hdf. Addestrare una seconda CNN per rilevare lo strato proteico M1 e la presenza di VRNP modificando la dimensione della scatola di addestramento da otto a quattordici.
Per curare le particelle, prima scarica i quaderni dal repository GitHub. Poi apri il notebook IPYNB che pulisce le particelle CNN e carica i moduli richiesti. Carica i file di testo delle coordinate HA e M1 nel notebook.
Visualizzali come nuvole 3D usando la libreria 3D aperta. Successivamente, filtrare i valori anomali delle coordinate HA utilizzando il metodo aperto di rimozione degli outlier statistici 3D. Successivamente, calcola le distanze tra le nuvole di punti HA e M1 identificando i punti HA a più di 20 pixel da M1 come valori anomali e salva le coordinate rimanenti in un file di testo in uscita.
Concatena tutte le particelle e salva come file star usando il file star pts2. IPYNB. Usando WarpTools, estrai le particelle che piegano il fattore di quattro ed esegui la media iniziale del subtomogramma in RELION meno quattro usando il codice. Converti il file a stella di teletrasporto in formato RELION quattro.
Successivamente genera un riferimento iniziale usando RELION refine MPI su un sottoinsieme di particelle. Esegui il raffinamento automatico 3D sui subtomogrammi con RELION Refine MPI. Alla convergenza, ripeti il raffinamento automatico con offset di traslazione del titano a otto e passo a due.
Sfrutta la classificazione 2D per scartare particelle di spazzatura usando la raffinazione RELION. Crea file stella con buone classi usando il codice, poi combina i singoli file stella. Tomogrammi rappresentativi hanno rivelato virioni pleomorfi con forme che variavano da sferiche a allungate.
La media finale del subtomogramma ha raggiunto una risoluzione globale di 6,0 angstrom con una risoluzione locale che varia da cinque a sette angstrom. Eliche alfa e fogli beta sono state risolte nella ricostruzione finale dell'HA, supportando la qualità strutturale della mappa raffinata. I siti di glicosilazione sono stati identificabili in quattro posizioni sulla testa e sul fusto dell'AH, confermando la visibilità della densità glicanica nella ricostruzione finale.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per studiare la conformazione dell'emagglutinina dell'influenza durante il legame al recettore utilizzando la crio-tomografia elettronica. Il protocollo consente la visualizzazione della morfologia e della struttura virale a risoluzione sub-nanometro.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Biologia strutturale
- Virologia
- Crio-tomografia elettronica
Sfondo
- I virus dell'influenza mostrano una morfologia pleomorfica.
- L'emagglutinina è una glicoproteina chiave coinvolta nel legame al recettore.
- Comprendere i cambiamenti conformazionali può informare gli studi sulla resistenza ai farmaci.
- La crio-tomografia elettronica offre capacità di imaging ad alta risoluzione.
Obiettivo dello studio
- Caratterizzare i cambiamenti conformazionali dell'emagglutinina durante il legame al recettore.
- Visualizzare l'organizzazione e la struttura dei virus dell'influenza.
- Migliorare la comprensione delle interazioni virali a livello molecolare.
Metodi utilizzati
- Crio-tomografia elettronica per l'imaging delle strutture virali.
- Media subtomogramma per il perfezionamento del modello.
- Tecniche di pre-elaborazione delle immagini per il miglioramento dei dati.
- Visualizzazione dell'emagglutinina in situ su virus intatti.
Principali risultati
- Imaging di successo dell'emagglutinina dell'influenza a risoluzione sub-nanometro.
- Identificazione di interazioni precedentemente nascoste durante il legame al recettore.
- Approfondimenti strutturali dettagliati sull'organizzazione del virus.
- Protocollo stabilito per futuri studi sulle glicoproteine virali.
Conclusioni
- Il protocollo consente un'analisi ad alta risoluzione dell'emagglutinina dell'influenza.
- I risultati contribuiscono alla comprensione della struttura e della funzione virale.
- Questo approccio può essere applicato ad altri studi virali nella biologia strutturale.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Subnanometer-resolution cryo-electron tomography of influenza hemagglutinin (HA) enables direct structural interrogation of viral glycoproteins in their native context, addressing a critical challenge in target validation for antiviral discovery. This workflow enhances predictive confidence in structure-based drug design and supports mechanistic de-risking at the earliest stages of antiviral portfolio development. The robust pipeline for HA visualization on intact virions positions structural biology as a foundational capability for translational virology programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of HA conformation and organization on pleomorphic influenza virions.
- Supports functional target validation by resolving glycosylation sites and protein-protein interactions at subnanometer scale.
- Facilitates mechanistic de-risking by revealing structural features relevant to receptor binding and membrane fusion.
- Improves predictive confidence for downstream inhibitor or vaccine design targeting HA.
Screening & Assay Development
- Provides validated structural templates for in silico screening and rational design workflows.
- Standardizes particle picking and subtomogram averaging for reproducible structural outputs.
- Enables quantitative assessment of glycoprotein density and distribution on virion surfaces.
- Supports assay development by confirming the presence and accessibility of key epitopes.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural findings with disease-relevant viral strains and glycoprotein variants.
- Enables continuity from molecular discovery to preclinical validation of HA-targeted interventions.
- Supports risk-adjusted advancement of candidates by providing high-resolution structural benchmarks.
Pipeline & Workflow Integration
This cryoET pipeline integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification and preclinical research for antiviral programs.
- Discovery Biology: Delivers high-resolution structural data to test mechanistic hypotheses about HA function and viral entry.
- Screening: Supplies reproducible, quantitative structural outputs for computational and experimental screening platforms.
- Analytics: Provides robust measurements of glycosylation, secondary structure, and protein organization for comparative analyses.
- Translational Research: Bridges molecular findings to preclinical models by characterizing clinically relevant viral strains.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, modular workflow for structural analysis of diverse viral glycoproteins.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in target structure and function.
- Operational Value: Standardizes data processing and analysis for reproducible, scalable outputs.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and prioritizes candidates with validated structural engagement.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement and triage of antiviral assets based on structural benchmarks.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryo-electron tomography, image processing, and neural network-based particle picking.
- Demands access to high-performance computing infrastructure and specialized software (e.g., EMAN2, RELION).
- Necessitates cross-team standardization of data formats, annotation, and quality control.
- Adaptation to other viral systems may require retraining of neural networks and protocol optimization.
- Resolution and throughput are limited by sample heterogeneity and data acquisition constraints.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:42
Preprocessing CryoElectron Tomograms and Convolutional Neural NetworkBased Particle Picking for HA Glycoprotein and M1 Protein Identification
5:32
Particle Curation and Subtomogram Averaging Workflow Using RELION and WarpTools
7:30
Results
