Un metodo minimamente invasivo per la generazione di un modello murino ortotopico singenico di carcinoma polmonare

La nostra ricerca attuale si concentra sulla comprensione delle malattie del cancro polmonare e su come sviluppare nuove modalità di trattamento compatibili con la terapia standard, inclusa chemioterapia, radioterapia e immunoterapia. Non siamo riusciti a trovare un modello ortotopico per il cancro polmonare che stabilisse criteri specifici per studiare specificamente il cancro ai polmoni in stadio precoce. Lavoriamo per fornire linee guida chiare e replicabili per colmare questa lacuna con questo protocollo.

Questo protocollo è minimamente invasivo e semplice da eseguire. Inoltre, con i criteri forniti, questo protocollo consente lo screening dell'impianto tumorale preciso e consente una diagnosi precoce tramite imaging bioluminescente. Questo protocollo consente ai ricercatori di studiare il tumore polmonare in stadio precoce nel tessuto ospite, consentendo l'avanzamento preclinico di nuove terapie oncologiche e l'indagine nel microambiente tumorale.

Utilizzeremo questa tecnica per valutare i meccanismi e l'efficacia di nuovi trattamenti entusiasmanti per il cancro ai polmoni in modo pre-clinico e speriamo che possa portare a cure future ai pazienti. Per cominciare, posiziona il topo anestetizzato in un cono nasale in posizione prona su un dispositivo riscaldante e applica una pomata oftalmica su entrambi gli occhi del topo. Una volta confermata l'anestesia, si utilizza una tagliacapelli elettrica per rimuovere il pelo da un'area rettangolare di due per tre centimetri sul lato dorsale sinistro del topo.

Radere dalla colonna mediale, la tavola lateralmente, l'ultima costola inferiormente e il bordo superiore della scapola verso la testa finché non si vede pelo. Metti il topo in una gabbia vuota su un dispositivo riscaldante. Osserva il ritmo respiratorio finché il topo non ritrova la vigilanza e poi riportalo nella gabbia di casa fino all'intervento.

Il giorno del prelievo cellulare, aggiungere un substrato fresco contenente 50 milligrammi per millilitro di Gentamicina alla piastra di coltura tre o quattro ore prima della prelieva. Aspira il substrato dalla piastra di coltura e lava le cellule attaccate con 1x PBS. Poi incubare le cellule con la soluzione di tripsina EDTA per uno o due minuti a 37 gradi Celsius.

Aggiungi un substrato fresco per neutralizzare la tripsina. Disperdere le cellule battendo delicatamente o pipettando la placca. Poi raccogli la sospensione della cella in un tubo conico da 50 millilitri.

Ora, centrifuga il tubo conico a 1.200 G per tre minuti a temperatura ambiente. Dopo aver confermato la presenza di un pellet compatto sul fondo, aspirare il sovrantantante e lavare il pellet con PBS. Risospendere la pellet cellulare lavata in PBS per raggiungere una concentrazione di circa uno a 2 milioni di cellule per millilitro per il conteggio.

Filtra la sospensione attraverso un filtro a celle da 40 micrometri prima di procedere. Successivamente, combina 10 microlitri di sospensione a celle con 10 microlitri di tripan blu. Carica il campione colorato in un emocitometro e conta le cellule.

Calcola il numero totale di celle e la vitalità delle celle. Centrifugare nuovamente le celle a 1.200 G per tre minuti a temperatura ambiente e aspirare il PBS uscendo dalla pellet. Risospendere il pellet cellulare in 0,5 milligrammi per millilitro di gel Metra in PBS.

Regolare al numero di cellule desiderato in un volume totale di iniezione di 50 microlitri. Tieni la sospensione della cella sul ghiaccio per evitare la solidificazione del matrigel. Pulire il sito chirurgico dell'animale anestetizzato tre volte usando garze sterili, alternando tra Betadine e etanolo al 70%.

Posiziona un panno chirurgico sterilizzato con fenestrate con un'apertura di tre per quattro centimetri sopra il topo e posiziona strumenti chirurgici autoclave sopra il pandeggiamento. Utilizzando la pinza, identificare il bordo cranico della scapola e il bordo di coccolazione della gabbia toracica. Con la pelle tenuta tesa tra pollice e indice del chirurgo, eseguire un'incisione superficiale a cinque millimetri direttamente sotto la scapola usando una lama di bisturi taglia 10.

Poi usa forbici dritte da 115 millimetri per smussare il grasso sottocutaneo lontano dalle costole e dai muscoli intercostali senza tagliarli. Per fermare qualsiasi leggero sanguinamento causato da danni capillari, premere delicatamente un applicatore sterilizzato con punta di cotone sull'area sanguinante. Tieni aperta l'incisione usando micro add e pinze.

Partendo dalla settima vera costola, si usano pinze mediane curbate per contare verso l'alto e individuare la quarta e la quinta costola. Segna questa zona come sito di iniezione. Ora, inverti delicatamente il tubo di sospensione della cella tre o quattro volte per mescolarlo.

Poco prima dell'iniezione, preleva 50 microlitri della sospensione in una siringa sterile da 300 microlitri da 31 calibro da 8 millimetri, assicurandoti che non ci siano bolle. Posizionare una striscia di nastro metallico sterilizzato spessa quattro millimetri infilata sulla siringa per agire come tappo e controllare la profondità di iniezione. Inietta la sospensione da 50 microlitri a 90 gradi nello spazio intercostale tra le costole quattro e cinque direttamente sotto la quarta costola, e tieni l'ago in posizione per due o tre secondi.

Ritira lentamente l'ago con lo stesso angolo dell'inserimento e gettalo in un contenitore per oggetti taglienti. Infine, chiudi l'incisione cutanea usando due o tre punti quadrati nodati e applica adesivo chirurgico veterinario sulle suture per rafforzare la chiusura della ferita. L'imaging bioluminescente ha rilevato segnali associati al tumore nei topi sperimentali già un giorno dopo l'iniezione e la radiabilità è aumentata visibilmente nel tempo sia per 25.000 che per 50.000 cellule per gruppo di muri, con maggiore intensità osservata nel gruppo di 50.000 cellule.

Il flusso tumorale totale è aumentato esponenzialmente sia nei gruppi cellulari 25.000 che in quelli di 50.000 cellule, raggiungendo oltre 10 volte 10 alla potenza di otto fotoni al secondo entro il giorno 21 nel gruppo delle 50.000 cellule. I topi sham non hanno mostrato luminescenza né tumore visibile nei polmoni dissezionati, mentre i topi sperimentali hanno mostrato alta luminescenza e masse tumorali rosse nel tessuto polmonare. A 21 giorni dall'iniezione, i topi inclusi mostravano tumori confinati al lobo polmonare sinistro senza invasione nelle regioni circostanti.