Uso della microperfusione cerebrale a flusso aperto per la raccolta longitudinale di liquido interstiziale in un modello animale di glioblastoma

Stiamo caratterizzando componenti solubili di segnalazione all'interno del liquido interstiziale del tumore cerebrale che contribuiscono alla progressione della malattia e alla risposta al trattamento. La valutazione delle concentrazioni assolute di soluti all'interno del tumore cerebrale interstiziale rimane una sfida investigativa che richiede l'uso di metodi sperimentali sofisticati. Per cominciare, con un bisturi sterile, eseguire un'incisione sagittale in linea mediana lungo la superficie del cranio, partendo tra gli occhi e estendendosi caudalmente per 8-10 millimetri.

Poi usa le pinze sterili per ritrarre lateralmente la pelle dall'incisione mediana. Assicurati che sia il bregma che il lambda siano visibili e estendi l'incisione se necessario. Successivamente, con un bisturi sterile, incisi il periosto e ritrai lateralmente il tessuto con una pinza.

Applicare perossido di idrogeno dall'1%-3% con un applicatore sterile con punta di cotone per pulire la superficie del cranio. Ora usa una siringa di insulina da 0,3 a 1,0 millilitri per applicare uniformemente da 20 a 40 microlitri di adesivo dentale autoincisivo sulla superficie del cranio. Poi esponelo a una luce di polimerizzazione per incidere l'adesivo.

Una volta indurito, rimuovere eventuali eccessi di adesivo con applicatori sterili a punta di cotone e soluzione salina. Riposiziona la punta del trapano sulla coordinata guida cOFM. Imposta il trapano a 15.000 giri al minuto e pratica un foro per la bava usando la manopola micromanipolatrice DV.

Monitorare frequentemente lo spessore del cranio durante la perforazione e lavare con soluzione fisiologica per rimuovere i detriti e ridurre il calore. Ripeti la procedura di perforazione a ogni coordinate di viti di ancora. Ora installa viti di ancoraggio usando pinze sterili e un cacciavite sterile finché non vengono inseriti una o due lunghezze di filettatura in profondità.

Poi monta la guida cOFM e il gruppo fittizio nel portaguide e fissa il supporto al telaio stereotattico. Posiziona la punta guida sopra il foro della bava e abbassa lentamente fino alla profondità prestabilita a 1 millimetro al minuto. Applica l'agente cementante sul cranio in strati sottili e uniformi, coprendo le aree sotto e intorno alla guida e alle viti del cOFM.

Usa una lampada per indurimento dentale per indurire ogni strato prima di applicare il successivo. Assicurati che il cemento copra l'intera area tra i componenti evitando il cuneo di bloccaggio. Distogli il portaguida dalla guida cOFM e sollevalo lentamente usando la manopola DV del micromanipolatore.

Usando la pinza, rimuovi il cuneo di bloccaggio dalla guida cOFM e dall'assemblaggio fittizio. Solleva delicatamente il manichino dalla guida. Usa le manopole micromanipolatrici ML e AP per allineare l'assemblaggio dell'inserto infusione della siringa sulla guida cOFM.

Abbassa l'inserto d'infusione usando la manopola DV e fissalo in posizione reinserendo saldamente il cuneo di bloccaggio con la pinza. Ora inietta 3 microlitri di sospensione cellulare dalla siringa a 1 microlitro al minuto. Monitorare l'area intorno alla guida cOFM per assicurarsi che non venga alcun efflusso di sospensione a celle fuori dall'assemblaggio.

Usa delle pinze per rimuovere il cuneo di bloccaggio dalla guida e dall'inserto infusione. Poi solleva con cura l'inserto d'infusione dalla guida usando la manopola di regolazione DV. Pre-riempire le linee dei tubi push and pull con liquido cerebrospinale artificiale utilizzando siringhe di vetro ermeche ai gas.

Installa la sezione peristaltica del tubo nella testa della pompa della microperfusione. Collega la sacca di perfusità al tubo di spinta usando un connettore Luer lock. Poi collega l'inserto di campionamento al tubo usando connettori a flangia.

Collega l'albero di ingresso più lungo all'estremità di uscita del tubo di spinta e l'albero di uscita più corto all'estremità di ingresso del tubo di trazione. Inserire l'inserto di campionamento collegato in un tubo sterile per microcentrifuga contenente 750 microlitri di liquido cerebrospinale artificiale. Collega l'ago del collettore di frazioni alla linea di uscita del tubo di trazione usando un connettore per tubi a flangia.

Poi esegui un lavaggio del tubo per 20 minuti a 10 microlitri al minuto per eliminare le bolle d'aria. Successivamente, riempi la linea del tubo di trazione con liquido cerebrospinale artificiale usando siringhe a tenuta di gas. Reinstalla il tubo peristaltico nella testa della pompa della microperfusione.

Collega di nuovo l'inserto di campionamento usando connettori per tubi a flangia. Collega l'ingresso all'estremità di uscita del tubo di trazione e l'uscita all'estremità di ingresso del tubo di trazione. Inserire l'inserto in un tubo sterile per microcentrifuga con 750 microlitri di liquido cerebrospinale artificiale.

Esegui un altro lavaggio del sistema di tubi di 20 minuti a 10 microlitri al minuto per eliminare eventuali bolle d'aria residue. Metti un animale anestetizzato in una giacca della misura appropriata. Fai passare completamente gli arti anteriori attraverso le ascelle e fissa saldamente la giacca lungo la schiena dell'animale.

Usa una pinza per rimuovere il cuneo di bloccaggio dalla guida e dal montaggio del dummy. Poi solleva con cura l'inserto del dummy dalla guida. Installa delicatamente l'inserto di campionamento nella guida e reinserisci il cuneo di bloccaggio.

Rimuovi l'animale dall'anestesia e inseriscilo nel sistema di gabbia rotante. Attacca il cavo della gabbia alla giacca degli animali e attiva il sistema di gabbia rotante. Dopo il campionamento cOFM, disattivare il sistema di gabbia rotante e staccare il cavo della gabbia dalla giacca animale.

Ora usa le pinze per rimuovere il cuneo di bloccaggio dalla guida e dall'inserto di campionamento. Solleva con cura l'inserto di campionamento dalla guida, poi inserisci delicatamente l'inserto finto nella guida e reinserisci il cuneo di bloccaggio. Stacca i chiusi sul retro della giacca dell'animale e togli delicatamente la giacca dall'animale.

L'imaging bioluminescente ha confermato la presenza di tumori negli animali con ingerto cellulare tumorale mediato dalla guida cOFM. L'analisi proteomica delle componenti principali del fluido interstiziale campionato con cOFM ha rivelato una netta separazione tra gruppi animali trattati con temozolomide e quelli trattati con dimetil solfosdo. Le distribuzioni globali del segnale metabolomico si sovrappongono quasi perfettamente tra i campioni di temozolomide e dimetilsolfosdo.

Nonostante la sovrapposizione dei segnali, l'analisi vulcanica metabolomica ha rivelato uno spostamento distinto guidato dal temozolomide. Confronti quantitativi dei valori metabolomici degli stessi animali hanno mostrato che le configurazioni ricircolate miglioravano le concentrazioni degli analiti preservando al contempo proporzioni relative di metaboliti. La disponibilità relativa di nutrienti all'interno del microambiente del tumore cerebrale rimane poco compresa.

Questo protocollo viene utilizzato per colmare questa lacuna. Caratterizzare la disponibilità e la segnalazione dei nutrienti all'interno del microambiente tumorale può chiarire i meccanismi della progressione del glioma e della resistenza adattativa al trattamento.