Saggio combinato di amplificazione della polimerasi ricombinata CRISPR/Cas12a per il rilevamento di Fusarium oxysporum f. sp. cubense Tropical Race 4

Siamo interessati alla rilevazione rapida e precisa della fusarium, il patogeno della banana, noto come Foc TR4. L'uso combinato di amplificazione della polimerasi recombinasi e CRISPR elimina l'uso di macchine costose e migliora la precisione degli saghi di corrente. Per cominciare, trasferire 250 milligrammi di ogni pezzo di pseudostelo sintomatico in una sacca di estrazione separata.

Aggiungere due millilitri di soluzione di idrossido di sodio a 0,5 molari di polivinilpirrolidone in ogni sacco di estrazione contenente materiale vegetale. Utilizzando un tritacaffè manuale, come un pestello, macina accuratamente i vasi infetti all'interno del sacchetto di estrazione. Poi aggiungi 195 microlitri di Tris-HCl buffer da 100 millimolari al pH otto in un tubo da 1,5 millilitri.

Pipetta cinque microlitri dell'estratto vegetale dalla sacca di estrazione nel tubo da 1,5 millilitri contenente il tampone Tris-HCl per diluire l'estratto di 40 volte. Fai un vortice sul tubo per 15-30 secondi e conservalo a meno 20 gradi Celsius fino a un ulteriore utilizzo. Utilizzando il kit di trascrizione dell'RNA, aggiungere i componenti forniti a un tubo PCR da 0,2 millilitri.

Incubare il tubo preparato a 37 gradi Celsius in un bagno-maria o in una macchina PCR per almeno quattro ore. Ora, usa uno spettrofotometro per quantificare l'RNA trascritto. Diluire l'RNA a una concentrazione di 250 nanogrammi per microlitro in un volume finale di 40 microlitri utilizzando acqua priva di nucleasi.

Poi, trattare il campione di RNA con DNasi che ho fornito nel kit di pulizia dell'RNA seguendo le istruzioni del produttore. Dopodiché, pulisci il campione di RNA usando il kit di pulizia dell'RNA. Usa un dispositivo NanoDrop per determinare la quantità e la qualità dell'RNA CRISPR pulito.

Poi, diluire l'RNA a 100 nanogrammi per microlitro con acqua priva di nucleasi. Ora, riscalda l'RNA CRISPR mescolato con il colorante di carico di RNA a 70 gradi Celsius per 10 minuti in un bagno d'acqua, e fai eseguire il campione su un gel al 1,5% di agarosio per visualizzare l'RNA CRISPR tramite elettroforesi. Prepara 20 microlitri di miscela reazionale Cas12a in un tubo separato da 0,5 millilitri utilizzando i componenti forniti.

Successivamente, preparare 9,5 microlitri di miscela di reazione RPA in un tubo separato da 0,5 millilitri con i componenti qui mostrati. Posiziona una striscia da otto tubi in un rack per tubi sul ghiaccio e trasferisci i 20 microlitri di miscela di reazione Cas12a alla base di ogni tubo della striscia. Successivamente, trasferire i 9,5 microlitri di miscela di reazione RPA nel coperchio di ogni tubo della striscia.

Aggiungi 0,5 microlitri di 280 nanomolari di acetato di magnesio al mix RPA nel coperchio, e mescola pipettando su e giù. Successivamente, aggiungi 0,5 microlitri di acqua deionizzata al coperchio del tubo di controllo non a modello e chiudelo con attenzione per evitare che le miscele di reazione RPA e Cas12a si mescolino. Ora, aggiungi 0,5 microlitri di DNA modello ai 10 microlitri di miscela di reazione RPA contenente acetato di magnesio nel coperchio della striscia del tubo.

Mescola il contenuto pipettando su e giù. Chiudi con cura tutti i coperchi delle strisce per assicurarti che le miscele di reazione RPA e Cas12a non si mescolino. Successivamente, accendi il fluorimetro portatile e crea un profilo di esecuzione per il test RPA Cas12a.

Apri il profilo di corsa salvata e posiziona la striscia di tubo all'interno del fluorimetro per incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo 30 minuti, rimuovi la striscia del tubo dal fluorimetro, inverti il tubo sei volte per mescolare le reazioni RPA e Cas12a, e fai girare brevemente la striscia in una mini centrifuga per cinque secondi. Poi, riporta la striscia di tubo al fluorometro e incuba per altri 30 minuti a 37 gradi Celsius usando il profilo di corsa salvata (salva run).

Interpretare le unità medie relative di fluorescenza misurate sul fluorimetro portatile. Infine, visualizza i tubi di reazione sotto luce blu LED a una lunghezza d'onda di eccitazione di 465 nanometri usando un transilluminatore di luce blu, e cattura immagini del segnale fluorescente con una fotocamera telefonica. I campioni positivi hanno prodotto fluorescenza visibile nel fluorimetro portatile Genie III dopo la rilevazione da parte RPA Cas12a del DNA Foc TR4, mentre i campioni negativi hanno prodotto una bassa fluorescenza finale.

Quando osservati sotto luce blu LED, i tubi campioni contenenti DNA proveniente da materiale vegetale infetto da Foc TR4 mostravano fluorescenza visibile, mentre i tubi con DNA di tessuto non infetto non mostravano alcuna fluorescenza. Abbiamo sviluppato il primo test che impiega la tecnologia CRISPR per il rilevamento di Foc TR4. Una volta ottimizzato, il saggio offre una rilevazione più rapida e precisa su macchine economiche rispetto ai saghi commerciali esistenti.

Il nostro lavoro successivo esplorerà un rilevatore fluorescente collegato a uno smartphone da combinare con il saggio.