Produzione e utilizzo di stampi di agarosio personalizzabili per la coltura di follicoli ovarici di topo senza scaffold

La nostra ricerca mira a sviluppare metodi personalizzabili, fisiomimetici e senza impalcature per determinare se possano migliorare la qualità dei follicoli cresciuti in vitro e degli ovociti che sviluppano. Attualmente, il metodo di coltura più avanzato utilizza un sistema di crescita follicoleare in vitro incapsulato in idrogel, che permette ai follicoli di mantenere la loro architettura tridimensionale durante la follicologenesi. L'incapsulamento dell'idrogeno è tecnicamente impegnativo, laborioso, a basso rendimento e purtroppo non è compatibile con i metodi di imaging automatico.

Inoltre, l'incapsulamento 3D fornisce un supporto uniforme, che non imita la fisiologia in vivo. Abbiamo creato stampe 3D biocompatibili che supportano le cellule altamente sensibili degli ovociti. I follicoli coltivati in ambiente senza impalcature hanno mostrato crescita e ovulazione migliorate senza compromettere la produzione ormonale rispetto alle tecniche consolidate.

Stiamo affrontando la necessità di un sistema di coltura facile da usare e personalizzabile che possa imitare meglio l'ambiente naturale dei follicoli. L'imaging time-lapse consente anche il monitoraggio e l'analisi in tempo reale delle prestazioni dei follicoli. Per cominciare, avvia il software CAD su un sistema informatico.

Apri il file step step di progettazione della base dello stampo master a 24 pozzi sul software. Seleziona l'area di superficie interna dell'oggetto. Poi vai alla scheda Solido nell'area di lavoro di progettazione e seleziona Crea Schizzo per inserire il design del microstampo desiderato.

Ora, introduciamo le dimensioni e il numero desiderato di x e y dei micropozzi. Poi seleziona Completa Schizzo nella barra degli strumenti. Crea i micropozzi profondi 800 micrometri utilizzando la funzione Estusura selezionando sequencialmente Solido, Crea ed Estrude.

Ora, scegli un fillet con raggio di 0,1 millimetri per la parte superiore dei micropozzi cliccando su Design, Solid, Modifica e Fillet. Aggiungi un filletto di raggio di 0,25 millimetri per creare un micropozzo a fondo rotondo. Salva il nuovo design dello stampo master ed esporta una copia in formato step selezionando File e premendo Export.

Apri il contenitore a 24 pozzi in silicone fuso a un passo. Poi inserisci il nuovo design dello stampo master come componente esterno cliccando con il tasto destro sul file salvato e selezionando Inserisci nel progetto attuale. Successivamente, clicca con il tasto destro sul componente inserito e seleziona Break Link per rimuovere il riferimento al design dello stampo master.

Centra il nuovo design dello stampo master all'interno della superficie unica del contenitore in silicone a 24 pozzi, assicurandolo rivolto verso l'interno. Seleziona OK per allineare gli oggetti. Seleziona l'operazione Cut, usando il contenitore come corpo target e lo stampo master come corpo dello strumento per creare la cavità di stampaggio in silicone.

Salva ed esporta il nuovo stampo in silicone a 24 pozzi come file stl e step. Apri i file STL del nuovo contenitore in silicone a 24 pozzi uno e 24 pozzi in silicone fuso due utilizzando il software di preparazione della stampa 3D. Orienta la stampa con i micropilastri rivolti verso l'alto e usa la funzione Drill Hole per creare un'apertura larga un millimetro sul lato della stampa.

Stampare entrambi i progetti del contenitore con uno spessore di 25 micrometri. Lava le stampe finite secondo le istruzioni del produttore. Poi spruzza ampiamente la sezione del micropilastro con isopropanolo al 95%.

Rimuovi qualsiasi etanolo residuo con aria compressa. Dopo l'asciugatura e l'induritura, ispezionare ogni stampa con un microscopio stereoscopico. Assicurati con attenzione che tutti i micropilastri siano separati e uniformi sia in dimensione che nell'aspetto.

Dopo l'indurimento, copri l'esterno della stampa con Parafilm se il canale di trapano non è riempito e conserva fino a un ulteriore utilizzo. Successivamente, inserisci il silicone preparato in un essiccatore a vuoto per cinque minuti per rimuovere le bolle d'aria. Versare la miscela di silicone con un flusso uniforme nello stampo stampato in 3D, assicurandosi che il livello corrisponda o sia leggermente sotto la superficie dello stampo per la piattezza.

Rimuovere l'aria intrappolata con una punta di pipetta P200 e degassare nuovamente se necessario. Polimerizza il silicone a temperatura ambiente in un essiccatore per almeno cinque ore o preferibilmente durante la notte. Dopo l'indurimento, rimuovere il silicone dallo stampo e ispezionare i microstampi al microscopio stereoscopico.

Rimuovere qualsiasi materiale in eccesso dal canale di perforazione e scartare gli stampi con ponti o pozzi danneggiati. Successivamente, posiziona lo stampo in silicone nel contenitore due dello stampo in silicone per il secondo passaggio dello stampo, assicurandoti che l'apertura laterale sia allineata. Spruzza leggermente lo stampo in silicone con olio minerale sicuro per embrioni.

Rimuovere gli oli in eccesso dai micropozzi usando aria compressa. Ripeti la procedura di miscelazione con silicone e versa la nuova miscela nel secondo contenitore, mantenendo il livello a o sotto la superficie dello stampo. Il giorno dopo, separare il silicone dallo stampo stampato in 3D e gli stampi in silicone uno e due tra loro.

Dopo averli ispezionati microscopicamente, scartare gli stampi con micropilastri compromessi o olio in eccesso nei pozzi. Ora, lava lo stampo in silicone con etanolo al 70%. Lascialo asciugare all'aria per 30 minuti all'interno di una cappa a flusso laminare.

Una volta asciutto, inserisci lo stampo in una sacca di sterilizzazione prima di inserirlo in autoclavi. Piega leggermente la punta dello spogliatore per migliorare la precisione durante il trasferimento del follicolo. Trasferisci rapidamente i follicoli per prevenire fluttuazioni di pH o temperatura.

Al microscopio, si utilizza una punta defilatrice da 200 micrometri per trasferire 10 follicoli secondari multistrato per microstampo, posizionandoli in micropozzi adiacenti. Conferma che tutti e 10 i follicoli abbiano dimensioni simili prima di finalizzare la configurazione. Successivamente, posiziona un tappo per il focheggiatore luminoso su un microscopio portatile.

Inserisci il microscopio con supporto in un incubatore e collegati a un laptop tramite il software. Posiziona e allinea bene la coltura al microscopio e regola altezza e messa a fuoco in modo che tutti i follicoli siano visibili. Usa bilanciamento del bianco automatico, AWB e controllo LED.

Disattiva l'esposizione automatica, l'AE e seleziona il tempo di esposizione ottimale. Inizia l'imaging time-lapse con una durata di otto giorni e un intervallo di 30 minuti. Seleziona la foto e spegni il LED quando non stai scattando immagini.

I follicoli coltivati in microstampi di agarosio hanno mostrato crescita continua e formazione di cavità antrale. Dopo l'induzione dell'ovulazione, i follicoli coltivati in microstampi di agarosio hanno prodotto più ovuli ovulati rispetto a quelli in alginato. A ulteriore dimostrazione della biocompatibilità, la morfologia del fuso delle uova M2 non differiva significativamente tra i gruppi.

I follicoli incapsulati in alginato non hanno mantenuto la loro posizione durante la coltura e sono incompatibili con l'imaging in time-lapse. Durante l'imaging time-lapse, la morfologia dei singoli follicoli, inclusi diametro, circolarità e rapporto d'aspetto di Feret, poteva essere tracciata e misurata istantaneamente durante tutto il periodo di cultura. La tomografia di coerenza ottica ha permesso la visualizzazione 3D delle strutture follicoli interne e ha anche catturato gli eventi dinamici di rottura dei follicoli durante l'ovulazione.

I microstampi di agarosio hanno permesso l'analisi istologica di molteplici follicoli nello stesso piano dopo l'immersione e la sezionazione della paraffina, permettendo l'identificazione della presenza o assenza di tessuto e supportando la colorazione H&E. Per dimostrare la personalizzazione di questo metodo, fu creata una versione ad alta produttività con 96 pozzi con 10 micropozzi per stampo e fu realizzata con successo. Come per il design a 24 pozzi, era compatibile con l'imaging a time-lapse dei follicoli.